Учитывая многообразие клеток иммунной системы, их идентификация и оценка активности является первоочередным мероприятием по оценке функции иммунитета. В общей практике такие исследования проводятся еже-дневно в большом количестве при исследовании клинического анализа крови (см. выше). Однако для детального изучения клеток иммунной системы этого исследования недостаточно. В клинической практике и научных исследова-ниях широкое применение нашли методы, основанные на идентификации по-верхностных дифференцировочных антигенов на клетках иммунной системы с помощью моноклональных антител. Суть метода заключается в связывании дифференцировочных АГ лимфоцитов с моноклональными АТ и дальней-шим их окрашиванием антиглобулиновыми АТ, меченными флуорохромом (метод непрямой иммунофлуоресценции). В дальнейшем происходит изме-рение меченых клеток с помощью различных методов, где безусловным ли-дером является проточная цитометрия.
Проточная цитофлуориметрия – современная технология быстрого из-мерения характеристик клеток при помощи моноклональных антител или других зондов, позволяющая судить об их типе (по наличию того или иного набора клеточных маркеров) и их функциональном состоянии (по изменению протекающих в них процессов).
Созданная для ускорения анализа в клинической цитологии и цитодиа-гностике, эта технология постепенно развилась в эффективный подход к ре-шению многих важных задач биологии клетки, иммунологии, клеточной ин-женерии и т.д. Области применения проточной цитометрии весьма разнооб-разны.
Помимо морфологических характеристик клеток с помощью монокло-нальных АТ можно достоверно определять популяционный и субпопуляци-онный состав лимфоцитов, выявлять стадию дифференцировки и активации клеток, оценивать уровень функциональной активности лимфоцитов, опреде-лять внутриклеточные и секретируемые цитокины, проводить исследования фагоцитоза; анализировать клеточный цикл, оценивать апоптоз и пролифе-рацию. Технология измерения различных характеристик клеток или их органелл.
Принцип работы проточного цитометра
Клеточная суспензия, пред-варительно меченная флуоресци-рующими моноклональными АТ или флуоресцентными красителя-ми, подается к потоковому элемен-ту. Клетки идут одна за другой, где в проточной ячейке их пересе-кает лазерный луч, под действием которого окрашенные клетки флу-оресцируют. Далее через оптиче-скую систему излучение попадает на регистрирующее устройство, где в дальнейшем обрабатывается. С помощью проточной цитометрии можно определить размеры клетки, соотношение ядра и цитоплазмы,степень асимметричности и интенсивность флуоресценции. Допускается измерение до 21 флуоресцентно-го параметра одновременно при шести длин волн возбуждения (до 6 лазе-ров). При исследовании оцениваются свойств от нескольких десятков до не-скольких миллионов клеток.
Анализ параметров прямого (FS) и бокового (SS) светорассеяния поз-воляет получить информацию о таких параметрах клеток как относительный размер и «гранулярность», соответственно. После удаления эритроцитов из образца периферической крови на основании анализа FS и SS можно вы-явить три основные популяции лейкоцитов.
Анализ морфологических параметров лейкоцитов периферической крови при помощи проточной цитометрии
Во-первых, это лимфоциты, расположенные в левой нижней части ги-стограммы (рис)
Во-вторых, это моноциты, расположенные несколько выше по FS и правее по SS от популяции лимфоцитов.
В-третьих, это гранулоциты, расположенные выше по оси ординат и правее по оси абсцисс по сравнению с моноцитами.
Что же касается двух других популяций лейкоцитов – базофилов и эозинофилов, то для их выявления необходимо использовать флуорохром-конъюгированные моноклональные антитела, так как по параметрам свето-рассеяния они «накладываются» на популяции лимфоцитов и гранулоцитов соответственно. Дендритные клетки, которые могут обнаруживаться в незначительном количестве в периферической крови, по прямому и боковому светорассеянию обычно располагаются между лимфоцитами и моноцитами, не формируя четко оформленных популяций. Для их выявления также необходимо применять моноклональные антитела, конъюгированные с флуорохромами.
