Глава 8. Исследование гуморального звена иммунитета

Гуморальный иммунитет обеспечивается различными молекулами, которые осуществляют эффекторные и регуляторные функции иммунной системы. Их концентрация в организме обычно стабильно и изменяется при развитии каких-либо патологических процессов.

Наибольшее распространение в определении различных гуморальных показателей иммунитета получил метод иммуноферментного анализа (ИФА). Метод основан на регистрации комплекса АГ–АТ при помощи АТ, маркированных определенными ферментами, с последующим образованием легко регистрируемых продуктов ферментного превращения. С помощью ИФА можно определить уровень специфических АТ, общего IgE и специфических IgE- и IgG4-антител, различных цитокинов (IFN, IL и т.д.), аутоиммунные маркеры. Существуют два варианта ИФА. Первый – гомогенный, при котором ингибирование или активация фермента происходит в результате взаимодействия АГ–АТ без разделения компонентов реакции на несколько этапов. В медицинской практике гомогенный ИФА применяют для быстрого выявления низкомолекулярных АГ. Второй вариант – гетерогенный, при проведении этой методики требуется разделение компонентов реакции. Основа гетерогенного ИФА – прикрепление АГ или АТ к твердой фазе (обычно планшет из полимерного материала). В дальнейшем к АГ или АТ, «сидящему» на твердой фазе, присоединяются комплементарные АТ или АГ. Затем, образовавшиеся ИК метят ферментом, входящим в состав конъюгата, и на заключительном этапе наличие фермента выявляют с помощью хромогенной субстратной смеси. (рис. 60).

Рис.60 Принцип иммуноферментного анализа
Рис.60 Принцип иммуноферментного анализа

Для диагностики противоинфекционной защиты помимо ИФА применяются другие различные методы определения АТ в сыворотке крови больных к инфекционным АГ. Для этого используют серологические методы диагностики пассивной и активной гемагглютинации связывания комплемента и т.д., хотя с активным внедрением ИФА эти методы применяются все реже.

Для определения ЦИК в сыворотке крови человека используют метод нефелометрии, основанный на различной растворимости мономеров иммуноглобулинов в составе ЦИК при наличии в среде полиэтиленгликоля. Установление уровня ЦИК в сыворотке крови – один из диагностических приемов определения степени тяжести и активности иммунопатологических процессов. Этот метод, так же, как и метод радиальной иммунодиффузии в геле, недорогой, прост в постановке, имеет большую диагностическую значимость. Обнаружение ЦИК полезно при оценке и мониторинге активности аутоиммунных, аллергических и инфекционных заболеваний. Увеличение его концентрации выше 90 о.е. свидетельствует о наличии иммунокомплексного синдрома.

Более значимо для оценки патологических состояний определение ИК, фиксированных в тканях и сосудах с помощью гистохимических исследований. Но за счет большой сложности и трудоемкости использование таких методов ограничено.

Тесты по выявлению комплемента подразделяются на два типа. Определение общей гемолитической активности – принцип основан на лизисе эритроцитов сенсибилизированными АТ в присутствии комплемента. Инкубируя такие эритроциты с различными разведениями комплемента, можно провести его полуколичественное определение. За единицу количества комплемента принимают активность, необходимую для гемолиза 50% эритроцитов. И выявление активности комплемента его отдельных компонентов с помощью ИФА.

Оценка функциональных свойств комплемента существенна у больных с подозрением на врожденный дефицит комплемента и полезна при наблюдении больных с различными иммунными расстройствами, мониторинге эффекта лечения.

Преимущество ИФА не обсуждается не даром он занимает ведущее местов идентификации различных молекул, однако в последние годы получил развитие мультиплексный анализ (рис.61).

Рис.61. Комплект оборудования на платформе Luminex для проведения мультиплексного анализа.
Рис.61. Комплект оборудования на платформе Luminex для проведения мультиплексного анализа.

Система MAGPIX® является современным комплексным решением на основе эффективной технологии Luminex® xMAP® для скрининга биомаркеров и анализа белков, а также с доступом к крупнейшему ассортименту мультиплексных наборов. В качестве партнера компании Luminex, Merck является дистрибьютером целого спектра приборов Luminex, включая LX 200™, FLEXMAP™ 3D и MAGPIX® платформы, охватывающие полный спектр возможностей мультиплексного анализа.

Система MAGPIX®: CCD-приборы, включающие основные компоненты сбора данных xMAP®, а также высокоскоростную и точную систему детекции, благодаря использованию магнитных частиц.

Рабочий процесс технологии xMAP®Глава 8. Исследование гуморального звена иммунитета

Luminex использует запатентованные технологии для создания внутреннего цветового кода микросфер с двумя флуоресцентными красителями.

За счет точных концентраций данных красителей могут быть созданы 100 различных наборов окрашенных частиц, каждый из которых покрыт специфичными антителами.

Глава 8. Исследование гуморального звена иммунитета

После того как аналит из тестового образца захватывается частицей, вводятся биотинилированные антитела для детекции.

Реакционная смесь затем инкубируется с стрептавидиновым – РЕ (фикоэритрин) конъюгатом, репортной молекулой, для завершения реакции на поверхности каждой микросферы.

Микросферы переносятся в магнитную камеру с LED, который возбуждает внутренние красители, маркирующие набор микрочастиц.

А также РЕ, флуоресцентный краситель на репортной молекуле. MAGPIX получает изображения частиц в камере с помощью CCD камеры (рис.62).

Алгоритмы обработки изображений позволяют получить результаты анализа в виде суммарной таблицы.

Рис. 62 Принцип работы мультиплексного анализа.
Рис. 62 Принцип работы мультиплексного анализа.

Преимущества xMAP при сравнении с другими современными системами детекции аналитовв биологических жидкостях:

  • Скорость/Высокая производительность: возможность одновременного измерения концентраций большого числа различных аналитов в одном образце, что позволяет быстрее выполнять исследования, получая своевременные и исчерпывающие результаты, так важные для работы.
  • Универсальность: единая система, основанная на технологии xMAP®, может выполнять анализ в нескольких различных форматах, включая нуклеиновые кислоты и взаимодействие антиген-антитело, наряду с ферментативными, рецептор-лигандными и другими белковыми взаимодействиями.
  • Гибкость: технология может быть адаптирована под специфичные требования пользователя на основе целевых аналитов

Точность: технология xMAP® производит анализ в режиме реального времени и с высокой степенью точности осуществляет количественную оценку молекулярных взаимодействий.

  • Воспроизводимость: производство высокообъемных микросфер xMAP® позволяет стандартизировать анализ образцов в отличие от использования твердофазных плоских поверхностей.
  • Малый объем образца: при минимальной работе вручную вы можете проанализировать более 40 аналитов в одном образце, используя всего лишь 25 мкл исследуемого материала.
  • Технология, основанная на использовании магнитных частиц: быстрая и эффективная реакция на действие магнитного поля способствует ускорению и улучшению качества процедуры отмывки, включая использование опций с высокой пропускной способностью.

Модификацией ИФА является и метод ELISPOT (от англ. Enzyme-Linked ImmunoSpot). позволяет идентифицировать конкретные антитела или цитокины, выделяемые живыми клетками. Принцип заключается в специфической реакции сенсибилизированных антител с секретируемыми клеткой молекулами. В результате этой реакции формируются окрашенные точки (пятна)

Стадии метода ELISPOT.

Глава 8. Исследование гуморального звена иммунитета

Метод ELISPOT исходно предназначался для количественного определения В-лимфоцитов, секретирующих специфические антитела. В дальнейшем этот анализ был адаптирован к различным задачам, и, прежде всего, к идентификации и количественному определению клеток, вырабатывающих цитокины. ELISPOT позволяет визуализировать секретируемый продукт на поверхности активированной или стимулированной к иммунному ответу индивидуальной клетки, что дает и качественную (тип иммунного белка), и количественную (число отвечающих клеток) информацию.

Каждое пятно в общем случае представляет собой единственную клетку, секретирующую специфический цитокин. Пятна подсчитываются либо вручную (с помощью стереомикроскопа), либо с использованием ELISPOT-ридеров (рис.63), которые обладают компьютерными возможностями визуализации активно продуцируемых цитокинов. Это позволяет максимально автоматизировать анализ и обеспечить более высокую его точность.

Рис.63. ELISPOT-ридер: AID EliSpot Reader. Визуализация ELISPOT-анализа с помощью автоматического ридера
Рис.63. ELISPOT-ридер: AID EliSpot Reader.
Визуализация ELISPOT-анализа с помощью автоматического ридера

Благодаря уникально высокой чувствительности ELISPOT-анализа, идентификация малочисленных клеточных популяций (при антиген-специфичных ответах), которая была недоступна ранее, теперь стала относительно простой задачей. Такая уникально высокая чувствительность, во многом, определяется тем, что детектируемый продукт в момент анализа находится на поверхности секретирующей клетки, будучи связан с ее рецепторами, до того, как он растворится в супернатанте или деградирует. Это делает ELISPOT-анализ значительно более чувствительным, чем ИФА. Пределы его чувствительности ниже 1/100 000, что делает этот метод очень полезным для мониторинга антиген-специфичных ответов в различных областях иммунологических исследований, включая исследования рака, пересадку органов, инфекционные заболевания и разработку вакцин.

Метод ELISPOT, благодаря своей высокой чувствительности, воспроизводимости и простоте, остается сегодня эталонной технологией для измерения специфических ответов Т-лимфоцитов с применением в различных областях исследований (разработка вакцин, диагностика инфекционные заболевания, аллергии, опухоли и аутоиммунные заболевания). Так например в АО «Генериум» локализовано производство набора T-SPOT.TB® (компании Oxford Immunotech) для диагностики туберкулеза. Иммунный ответ на инфицирование М. tuberculosis является преимущественно клеточно-опосредованным. В процессе этого ответа, Т клетки сенсибилизируются к антигенам М. tuberculosis. Активированные эффекторные Т клетки, CD4 и CD8, выделенные из крови, могут быть подсчитаны благодаря способности стимулироваться этими антигенами in vitro. Применение специально подобранных антигенов ESAT-6 и CFP10, входящих в состав микобактерий комплекса М. tuberculosis (М tuberculosis, М bovis, М africanum), повышает эффективность и специфичность теста, так как эти антигены отсутствуют в БЦЖ и во многих других не вирулентных для человека микобактериях, находящихся в окружающей среде. Тесты ELISPOT могут быть использованы для оценки иммунной памяти (иммунного отклика), для определения количества специфичных для вирусных антигенов лимфоцитов, секретирующих цитокины, и для определения Т-хелперного профиля иммунного ответа вакцинированного.

Т-клеточный ответ важен для устранения вируса и контроля развития заболевания у пациентов с COVID-19, которые были естественно инфицированы SARS-CoV-2. В частности, набор Тигра-Тест® SARS-CoV-2 для выявления in vitro в крови Т-лимфоцитов, специфически отвечающих на антигены вируса SARS-CoV-2» позволяет подсчитать отдельные активированные SARS-CoV-2-специфичные Т-клетки.

Глава 8. Исследование гуморального звена иммунитета

В настоящее время некоторые биотехнологические компании наладили выпуск исследовательских наборов Т- и В-клеточных ELISPOT для SARS-CoV-2, что позволит качественно усилить борьбу с пандемией COVID-19.

 

Мультиплексной модификацией метода ELISPOT является метод FLUOROSPOT. Основное отличие состоит в том, что анализ FLUOROSPOT позволяет одновременно выявлять наличие нескольких аналитов на одном планшете с лунками, за счет использования флуоресценции, а не ферментативной реакции для обнаружения (рис.64).

Рис. 64. AID CoV-iSpot обнаруживает реакцию IFN-γ и IL-2 специфически активированных Т-клеток против коронавирусов (смесь пептидов PAN-Corona) и / или SARS-CoV-2 (смесь пептидов SARS-CoV-2).
Рис. 64. AID CoV-iSpot обнаруживает реакцию IFN-γ и IL-2 специфически активированных Т-клеток против коронавирусов (смесь пептидов PAN-Corona) и / или SARS-CoV-2 (смесь пептидов SARS-CoV-2).

В ближайшее время для идентификации аналита будет использоваться, масс-спектрометрия с мониторингом множественных реакций (MRM). Анализы MRM основаны на определении пептидах целевых белков, которые уникальны для протеолитически расщепленных белков. Обнаружение и количественная оценка основаны на выборе этих конкретных пептидов и их фрагментов, а также на различении всех других аналитов в образце. Это исследование в отличие от анализов на основе антител позволяет одновременно обнаруживать и количественно определять несколько биомаркеров за один цикл анализа без необходимости в специфических антителах. Кроме того, анализы на основе MRM для абсолютного количественного определения являются более экономичными по времени и стоимости для каждого параметра и образца, чем ELISA, и можно легко добавлять новые аналиты.  Таким образом, MRM облегчает количественную оценку белков в широком динамическом диапазоне в сложной матрице образца, такой как сыворотка человека. За последнее десятилетие методы MRM на основе пептидов успешно применялись для обнаружения и количественного определения биомаркеров, например, для заболеваний коронарных артерий, различных типов рака, гипертонии, артрита и ограничения внутриутробного развития.

вверх

Заказать обратный звонок