Прочие методы исследования клеточного звена иммунитета

Не менее важным является оценка клеточного компонента эффекторного ответа. В отличие от гуморального звена иммунитета, сделать это достаточно сложно, т.к. основное количество клеток иммунной системы находится в тканях и прежде всего в слизистых и коже (барьерные органы). Однако используя ме-тод ELISPOT (англ. Enzyme-Linked ImmunoSPOT analysis) возможно оценить специфический ответ к тому или иному патогену.
Принцип метода заключается в специфической реакции сенсибилизированных антител с секретируемыми клеткой молекулами. В результате этой реакции формируются окрашенные пятна (споты). Технология проведения исследования представлена на рисунке.

Стадии метода ELISPOT

1

Прочие методы исследования клеточного звена иммунитета

Моноклональные или поликлональные антитела, специфические к определенному антигену наносятся на микропланшет со специальным носителем

2

Прочие методы исследования клеточного звена иммунитета

Блокировка несвязанных сайтов с помощью протеина

3

Прочие методы исследования клеточного звена иммунитета

К носителю с антителами добавляются анализируемые клетки и специфический антиген (например, ESAT6 и CFP10 при диагностике туберкулезной инфекции)

4

Образец подвергается инкубации в специальных условиях в течение некоторого времени. Если клетки из исследуемого образца крови уже имели контакт с данным антигеном, то во время инкубации они активируются и начинают выделять специфические цитокины. Выделенные цитокины связываются с антителами, нанесенными на поверхность носителя

5

Прочие методы исследования клеточного звена иммунитета

После окончания периода инкубации клетки антиген и субстрат смывают с поверхности носителя. На нем остаются только антитела и связавшиеся с ними цитокины

6

Прочие методы исследования клеточного звена иммунитета

Добавляются моноклональные вторичные анти-цитокиновые антитела

7

Прочие методы исследования клеточного звена иммунитета

Добавляется стрептавидин-пероксидаза

8

Прочие методы исследования клеточного звена иммунитета

Добавляется хромогенный субстрат и контролируется формирование окрашенных точек. В результате окраски на образце образуются специфические пятна, давшие название анализу (от англ. spot — пятно)

Каждое пятно представляет собой единственную клетку, секретирующую специфический цитокин. Пятна подсчитываются либо вручную (с помощью стереомикроскопа), либо с использованием ELISPOT-ридеров, которые облада-ют компьютерными возможностями визуализации клеток, активно продуциру-ющих цитокины.
Благодаря уникально высокой чувствительности ELISPOT-анализа иден-тификация малочисленных клеточных популяций (при антиген-специфичных ответах), которая была недоступна ранее, теперь стала относительно простой за-дачей. Такая уникально высокая чувствительность во многом, определяется тем, что цитокины связываются буквально рядом с секретирующими их клетками, до растворения в супернатанте и до захвата рецепторами соседних клеток или разрушения. Это делает ELISPOT-анализ значительно более чувствительным, чем ИФА. Пределы его чувствительности ниже 1/100 000, что делает этот метод очень полезным для мониторинга антиген-специфичных ответов в различных областях иммунологических исследований, включая исследования рака, пере-садку органов, инфекционные заболевания и разработку вакцин.
Метод ELISPOT, благодаря своей высокой чувствительности, воспроизво-димости и простоте, остается сегодня эталонной технологией для измерения специфических ответов Т-лимфоцитов с применением в различных областях ис-следований (разработка вакцин, диагностика инфекционных заболевания, ал-лергии, опухоли и аутоиммунных заболеваний). Так, например, в АО «Генери-ум» локализовано производство набора T-SPOT.TB® (компании Oxford Immunotech) для диагностики туберкулеза. Иммунный ответ на инфицирование М. tuberculosis является преимущественно клеточно-опосредованным. В процессе этого ответа, Т- клетки сенсибилизируются к антигенам М. tuberculosis. Активированные эф-фекторные Т-клетки, CD4 и CD8, выделенные из крови, могут быть подсчитаны благодаря способности стимулироваться этими антигенами in vitro. Применение специально подобранных антигенов ESAT6 и CFP10, входящих в состав мико-бактерий комплекса М. tuberculosis (М. tuberculosis, М. bovis, М. africanum), по-вышает эффективность и специфичность теста, так как эти антигены отсутству-ют в штамме БЦЖ и во многих других не вирулентных для человека микобак-териях, находящихся в окружающей среде. Тесты ELISPOT могут быть исполь-зованы для оценки иммунной памяти (иммунного отклика), для определения количества специфичных для вирусных антигенов лимфоцитов, секретирующих цитокины, и для определения Т-хелперного профиля иммунного ответа вакци-нированного.
Платформа ELISPOT нашла свое применение и в комплексной оценке иммунного ответа на вирус SARS-CoV-2.

 

Пример оценки Т-клеточного ответа на SARS-CoV-2 методом ELISPOT

Прочие методы исследования клеточного звена иммунитета

Доказано, что Т-клетки являются более чувствительным индикатором перене-сенного COVID-19, чем ответы антител. Так, набор реагентов «Тигра-Тест® SARS-CoV-2» позволяет выявить in vitro в крови Т-лимфоциты, специфически отвечающие на антигены вируса SARS-CoV-2. По количеству SARS-CoV-2-специфичных Т-клеток можно сделать вывод о состоятельности Т-клеточного иммунного ответа. Кроме того, тест-система позволяет отличить иммунный от-вет, сформировавшийся в результате естественной встречи с вирусом от ответа Т-клеток на вакцину, несущую информацию о S-белке SARS-CoV-2.

Мультиплексной модификацией метода ELISPOT является метод FLUOROSPOT. Основное отличие состоит в том, что анализ FLUOROSPOT позволяет одновременно выявлять наличие нескольких аналитов на одном планшете с лунками за счет использования флуоресценции, а не ферментативной реакции для обнаружения.

 

AID CoV-iSpot обнаруживает реакцию IFN-γ и IL-2 специфически активированных Т-клеток против коронавирусов (смесь пептидов PAN-Corona) и/или SARS-CoV-2 (смесь пептидов SARS-CoV-2)

Прочие методы исследования клеточного звена иммунитета
Прочие методы исследования клеточного звена иммунитета

Адгезивную способность нейтрофилов можно измерить по прилипанию к волокнам из нейлона.
Миграцию и хемотаксис фагоцитирующих клеток оценивают при исполь-зовании агарозных тестов (реакция торможения миграции лейкоцитов). Погло-тительную способность лейкоцитов измеряют по захвату ими различных частиц (микроорганизмы, частицы латекса). Метаболическая активность клеток может быть оценена в тесте с нитросиним тетразолием (НСТ-тест) или с помощью хе-милюминесцентного метода.
Определяется поглотительная способность нейтрофилов с подсчетом фагоцитарного индекса, т. е. процента (относительного числа) фагоцитирующих нейтрофилов. Оценивается фагоцитарное число, или среднее число частиц, по-глощенных одним нейтрофилом. Метод основан в умении полиморфноядерных лейкоцитов (или моноцитов) периферической крови связывать на своей поверх-ности, поглощать и переваривать чужеродные агенты (микробные агенты, ин-дифферентные частицы, например, используемый в тестах латекс). Бактерицид-ная активность фагоцитов основана на подсчете жизнеспособных бактерий, оставшихся внутри клеток после инкубации. В норме фагоцитарный показатель составляет: спонтанный – 62–68%, стимулированный – 80–88%. Фагоцитарное число: спонтанное 3–5, стимулированное 7–11.
Фагоцитарная активность нейтрофилов обычно повышается в начале раз-вития воспалительного процесса. Ее снижение ведет к хронизации заболевания, развитию синдрома ИК за счет того, что нарушается функция разрушения и вы-ведения ИК.
НСТ-тест. Восстановление НСТ в фагоцитозе прямо зависит от эффек-тивности метаболических процессов в клетке. Интенсивность восстановления отражает активность генерации супероксидных радикалов. Этот метод является чувствительным индикатором раздражения клеток (спонтанный НСТ) и их функциональных резервов (стимулированный НСТ). В норме число НСТ-положительных нейтрофилов составляет 10 % (или 50–130 у.е.), после стимуля-ции – 40–80 % (80–200 у.е.).

Хемилюминесцентный метод. Уровень хемилюминесценции при фаго-цитозе характеризует интенсивность «респираторного взрыва» в клетках с продукцией активных форм кислорода, оказывающих бактерицидное дей-ствие. Первичные метаболиты активированного кислорода представляют собой супероксидный анион-радикал (О2-), перекись водорода (Н2О2), гидроксильный радикал (НО2), синглетный кислород (О2). В качестве основных вторичных ме-таболитов необходимо отметить гипохлорную кислоту (HClO), хлорамины и продукты перекисного окисления липидов. Взаимопревращения первичных и вторичных оксидантов с мощным энергетическим потенциалом создают дина-мический спектр молекул, которые прямо или косвенно вовлекаются в реакции фагоцитов. При этом взаимодействие высокоэнергетических оксидантов с лю-минесцирующими посредниками (люминол, люцигенин и др.) приводит к пере-ходу последних в электронно-возбужденное состояние, выход из которого со-провождается испусканием кванта света. Регистрация светоизлучения хемилю-минесцентной реакции производится на хемилюминометрах отечественного или зарубежного производства. Механизм хемилюминесценции лейкоцитов зависит от природы стимулирующего агента, отличаясь своей специфичностью. Доказа-на высокая степень корреляции между уровнем хемилюминесценции фагоцитов и киллингом, поэтому определение хемилюминесценции лейкоцитов может ис-пользоваться как один из критериев их способности к завершенному фагоцито-зу, позволяющих оценить функциональную активность лейкоцитов.
Основные нормативные показатели которой представлены в таблице.

Хемилюминесцентный анализ

Показатель

Ед. изм.

Нормативный показатель

Люминол-зависимая хемилюминесценция

 

Спонтанная

Индуцированная

 

Tmax -,

время, сек

636 — 1545

814 — 1526

 

Imax — интенсивность

о.е.

3110 — 14990

6220 — 26550

 

S — площадь

о.е.

20857435 — 160627588

3772475 — 439100000

 

Индекс активации

1,27 — 2,37

Люцигенин-зависимая хемилюминесценция

 

 

 

 

 

Tmax -,

время, сек.

941-2881

1389-2331

 

Imax — интенсивность

о.е.

2611-16536

7586-28960

 

S — площадь

о.е.

3950000-41114989

10700771-64610000

 

Индекс активации

1,17 — 3,10

 

МНЕНИЕ ИММУНОЛОГА

Добрый день, уважаемый коллега! Отправьте данные по пациенту и бесплатно получите консультацию клинического иммунолога с нашего сайта. Юридически данное заключение можно рассматривать как телемедицинскую консультацию.