Не менее важным является оценка клеточного компонента эффекторного ответа. В отличие от гуморального звена иммунитета, сделать это достаточно сложно, т.к. основное количество клеток иммунной системы находится в тканях и прежде всего в слизистых и коже (барьерные органы). Однако используя ме-тод ELISPOT (англ. Enzyme-Linked ImmunoSPOT analysis) возможно оценить специфический ответ к тому или иному патогену.
Принцип метода заключается в специфической реакции сенсибилизированных антител с секретируемыми клеткой молекулами. В результате этой реакции формируются окрашенные пятна (споты). Технология проведения исследования представлена на рисунке.
Стадии метода ELISPOT
1 | Моноклональные или поликлональные антитела, специфические к определенному антигену наносятся на микропланшет со специальным носителем | |
2 | Блокировка несвязанных сайтов с помощью протеина | |
3 | К носителю с антителами добавляются анализируемые клетки и специфический антиген (например, ESAT6 и CFP10 при диагностике туберкулезной инфекции) | |
4 | Образец подвергается инкубации в специальных условиях в течение некоторого времени. Если клетки из исследуемого образца крови уже имели контакт с данным антигеном, то во время инкубации они активируются и начинают выделять специфические цитокины. Выделенные цитокины связываются с антителами, нанесенными на поверхность носителя | |
5 | После окончания периода инкубации клетки антиген и субстрат смывают с поверхности носителя. На нем остаются только антитела и связавшиеся с ними цитокины | |
6 | Добавляются моноклональные вторичные анти-цитокиновые антитела | |
7 | Добавляется стрептавидин-пероксидаза | |
8 | Добавляется хромогенный субстрат и контролируется формирование окрашенных точек. В результате окраски на образце образуются специфические пятна, давшие название анализу (от англ. spot — пятно) |
Каждое пятно представляет собой единственную клетку, секретирующую специфический цитокин. Пятна подсчитываются либо вручную (с помощью стереомикроскопа), либо с использованием ELISPOT-ридеров, которые облада-ют компьютерными возможностями визуализации клеток, активно продуциру-ющих цитокины.
Благодаря уникально высокой чувствительности ELISPOT-анализа иден-тификация малочисленных клеточных популяций (при антиген-специфичных ответах), которая была недоступна ранее, теперь стала относительно простой за-дачей. Такая уникально высокая чувствительность во многом, определяется тем, что цитокины связываются буквально рядом с секретирующими их клетками, до растворения в супернатанте и до захвата рецепторами соседних клеток или разрушения. Это делает ELISPOT-анализ значительно более чувствительным, чем ИФА. Пределы его чувствительности ниже 1/100 000, что делает этот метод очень полезным для мониторинга антиген-специфичных ответов в различных областях иммунологических исследований, включая исследования рака, пере-садку органов, инфекционные заболевания и разработку вакцин.
Метод ELISPOT, благодаря своей высокой чувствительности, воспроизво-димости и простоте, остается сегодня эталонной технологией для измерения специфических ответов Т-лимфоцитов с применением в различных областях ис-следований (разработка вакцин, диагностика инфекционных заболевания, ал-лергии, опухоли и аутоиммунных заболеваний). Так, например, в АО «Генери-ум» локализовано производство набора T-SPOT.TB® (компании Oxford Immunotech) для диагностики туберкулеза. Иммунный ответ на инфицирование М. tuberculosis является преимущественно клеточно-опосредованным. В процессе этого ответа, Т- клетки сенсибилизируются к антигенам М. tuberculosis. Активированные эф-фекторные Т-клетки, CD4 и CD8, выделенные из крови, могут быть подсчитаны благодаря способности стимулироваться этими антигенами in vitro. Применение специально подобранных антигенов ESAT6 и CFP10, входящих в состав мико-бактерий комплекса М. tuberculosis (М. tuberculosis, М. bovis, М. africanum), по-вышает эффективность и специфичность теста, так как эти антигены отсутству-ют в штамме БЦЖ и во многих других не вирулентных для человека микобак-териях, находящихся в окружающей среде. Тесты ELISPOT могут быть исполь-зованы для оценки иммунной памяти (иммунного отклика), для определения количества специфичных для вирусных антигенов лимфоцитов, секретирующих цитокины, и для определения Т-хелперного профиля иммунного ответа вакци-нированного.
Платформа ELISPOT нашла свое применение и в комплексной оценке иммунного ответа на вирус SARS-CoV-2.
Пример оценки Т-клеточного ответа на SARS-CoV-2 методом ELISPOT
Доказано, что Т-клетки являются более чувствительным индикатором перене-сенного COVID-19, чем ответы антител. Так, набор реагентов «Тигра-Тест® SARS-CoV-2» позволяет выявить in vitro в крови Т-лимфоциты, специфически отвечающие на антигены вируса SARS-CoV-2. По количеству SARS-CoV-2-специфичных Т-клеток можно сделать вывод о состоятельности Т-клеточного иммунного ответа. Кроме того, тест-система позволяет отличить иммунный от-вет, сформировавшийся в результате естественной встречи с вирусом от ответа Т-клеток на вакцину, несущую информацию о S-белке SARS-CoV-2.
Мультиплексной модификацией метода ELISPOT является метод FLUOROSPOT. Основное отличие состоит в том, что анализ FLUOROSPOT позволяет одновременно выявлять наличие нескольких аналитов на одном планшете с лунками за счет использования флуоресценции, а не ферментативной реакции для обнаружения.
AID CoV-iSpot обнаруживает реакцию IFN-γ и IL-2 специфически активированных Т-клеток против коронавирусов (смесь пептидов PAN-Corona) и/или SARS-CoV-2 (смесь пептидов SARS-CoV-2)
Адгезивную способность нейтрофилов можно измерить по прилипанию к волокнам из нейлона.
Миграцию и хемотаксис фагоцитирующих клеток оценивают при исполь-зовании агарозных тестов (реакция торможения миграции лейкоцитов). Погло-тительную способность лейкоцитов измеряют по захвату ими различных частиц (микроорганизмы, частицы латекса). Метаболическая активность клеток может быть оценена в тесте с нитросиним тетразолием (НСТ-тест) или с помощью хе-милюминесцентного метода.
Определяется поглотительная способность нейтрофилов с подсчетом фагоцитарного индекса, т. е. процента (относительного числа) фагоцитирующих нейтрофилов. Оценивается фагоцитарное число, или среднее число частиц, по-глощенных одним нейтрофилом. Метод основан в умении полиморфноядерных лейкоцитов (или моноцитов) периферической крови связывать на своей поверх-ности, поглощать и переваривать чужеродные агенты (микробные агенты, ин-дифферентные частицы, например, используемый в тестах латекс). Бактерицид-ная активность фагоцитов основана на подсчете жизнеспособных бактерий, оставшихся внутри клеток после инкубации. В норме фагоцитарный показатель составляет: спонтанный – 62–68%, стимулированный – 80–88%. Фагоцитарное число: спонтанное 3–5, стимулированное 7–11.
Фагоцитарная активность нейтрофилов обычно повышается в начале раз-вития воспалительного процесса. Ее снижение ведет к хронизации заболевания, развитию синдрома ИК за счет того, что нарушается функция разрушения и вы-ведения ИК.
НСТ-тест. Восстановление НСТ в фагоцитозе прямо зависит от эффек-тивности метаболических процессов в клетке. Интенсивность восстановления отражает активность генерации супероксидных радикалов. Этот метод является чувствительным индикатором раздражения клеток (спонтанный НСТ) и их функциональных резервов (стимулированный НСТ). В норме число НСТ-положительных нейтрофилов составляет 10 % (или 50–130 у.е.), после стимуля-ции – 40–80 % (80–200 у.е.).
Хемилюминесцентный метод. Уровень хемилюминесценции при фаго-цитозе характеризует интенсивность «респираторного взрыва» в клетках с продукцией активных форм кислорода, оказывающих бактерицидное дей-ствие. Первичные метаболиты активированного кислорода представляют собой супероксидный анион-радикал (О2-), перекись водорода (Н2О2), гидроксильный радикал (НО2), синглетный кислород (О2). В качестве основных вторичных ме-таболитов необходимо отметить гипохлорную кислоту (HClO), хлорамины и продукты перекисного окисления липидов. Взаимопревращения первичных и вторичных оксидантов с мощным энергетическим потенциалом создают дина-мический спектр молекул, которые прямо или косвенно вовлекаются в реакции фагоцитов. При этом взаимодействие высокоэнергетических оксидантов с лю-минесцирующими посредниками (люминол, люцигенин и др.) приводит к пере-ходу последних в электронно-возбужденное состояние, выход из которого со-провождается испусканием кванта света. Регистрация светоизлучения хемилю-минесцентной реакции производится на хемилюминометрах отечественного или зарубежного производства. Механизм хемилюминесценции лейкоцитов зависит от природы стимулирующего агента, отличаясь своей специфичностью. Доказа-на высокая степень корреляции между уровнем хемилюминесценции фагоцитов и киллингом, поэтому определение хемилюминесценции лейкоцитов может ис-пользоваться как один из критериев их способности к завершенному фагоцито-зу, позволяющих оценить функциональную активность лейкоцитов.
Основные нормативные показатели которой представлены в таблице.
Хемилюминесцентный анализ
Показатель | Ед. изм. | Нормативный показатель | ||
Люминол-зависимая хемилюминесценция | ||||
| Спонтанная | Индуцированная |
| |
Tmax -, | время, сек | 636 — 1545 | 814 — 1526 |
|
Imax — интенсивность | о.е. | 3110 — 14990 | 6220 — 26550 |
|
S — площадь | о.е. | 20857435 — 160627588 | 3772475 — 439100000 |
|
Индекс активации | 1,27 — 2,37 | |||
Люцигенин-зависимая хемилюминесценция |
| |||
|
|
|
| |
Tmax -, | время, сек. | 941-2881 | 1389-2331 |
|
Imax — интенсивность | о.е. | 2611-16536 | 7586-28960 |
|
S — площадь | о.е. | 3950000-41114989 | 10700771-64610000 |
|
Индекс активации | 1,17 — 3,10 |
|