Глава 9. Молекулярно-генетические исследования в иммунологии

В основе этих методов лежат манипуляции с ДНК и/или РНК, и молекул формирующиеся в цепочки ген-белок-функция. Это сложные методы диагностики, требуют определённых лабораторных условий и подготовки квалифицированного персонала. Однако в последнее время в связи с внедрением автоматизации и информационных технологий они все шире внедряются в клиническую практику, а некоторые как например ПЦР практически вытеснили традиционные лабораторные исследования Первый этап всех методов – получение образцов ДНК или РНК и их идентификация, затем определение различных полипептидов и затем определение метаболических реакций реализуемых определенным пептидом.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Самый распространенный молекулярно-генетический метод исследования. На сегодняшний день существуют десятки модификаций этого метода, однако наиболее распространенной является ПЦР в реальном времени (qPCR, Real-Time PCR, ПЦР-РВ, кПЦР).

Принцип ПЦР основывается на многократной амплификации целевого фрагмента ДНК с помощью ДНК-полимеразы. Как известно, ДНК представляет собой двуцепочечную молекулу, состоящую из четырех типов нуклеотидов (дезоксинуклеозидтрифосфатов): аденозина, тимидина, цитидина и гуанозина. Цепи ДНК направлены антипараллельно и удерживаются вместе за счет водородных связей между азотистыми основаниями, входящими в состав нуклеотидов. Связи образуются по принципу комплементарности: аденин соединяется с тимином (или урацилом в РНК), а гуанозин – с цитидином. Таким образом, имея одну цепь ДНК, легко построить ее пару.

Цикл ПЦР состоит из трех этапов: денатурации, отжига праймеров и элонганции (синтеза ДНК) (рис. 65). Обычно выполняется 20-35 циклов.

Глава 9. Молекулярно-генетические исследования в иммунологии

Рис.65. Схема полимеразной цепной реакции

В результате число копий фрагмента растет в геометрической прогрессии и через 25 циклов амплификации синтезируются 106 таких копий. Благодаря этому происходит многократное увеличение количества специфических фрагментов ДНК, что значительно упрощает дальнейший анализ. (Рис. 66).

Рис.66. ПЦР анализ
Рис.66. ПЦР анализ

ПЦР состоит из трех основных процедур: 1) подготовка исследуемой пробы материала, которая в большинстве случаев сводится к выделению ДНК или РНК; 2) амплификации (собственно ПЦР); 3) детекция продукта ПЦР (амплифицированной нуклеиновой кислоты).

Для визуализации результатов амплификации используют различные методы. Ранее использовался метод электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по размеру. Однако этот метод не позволяет точно определить содержание ДНК в исходном образце. Для решения этой задачи используют метод ПЦР в реальном времени, или количественной ПЦР.

ПЦР в реальном времени. Для проведения ПЦР в реальном времени необходимы те же компоненты, что и для стандартной ПЦР, а также интеркалирующий краситель или флуоресцентный гибридизационные зонды. С их помощью возможна детекция накопления продуктов ПЦР оптическими датчиками, встроенными в амплификатор. Наиболее часто использующийся интеркалирующий краситель – SYBR Green I, резко увеличивающий флуоресценцию (в 1000 раз) после связывания с двухцепочечной ДНК. Среди флуоресцентных гибридизационных зондов наиболее популярны зонды типа TaqMan.

Рис.67. Амплификатор CFX96 Touch для проведения ПЦР в реальном времени.
Рис.67. Амплификатор CFX96 Touch для проведения ПЦР в реальном времени.

Они представляют собой небольшие олигонуклеотиды, комплементарные внутреннему участку амплифицируемого фрагмента ДНК, и содержат два флуорофора: репортер и гаситель. Пока зонд связан с матрицей, гаситель поглощает флуоресцентный сигнал от репортера, однако когда ДНК-полимераза доходит до зонда, она его разрушает, репортер и гаситель отдаляются друг от друга, и флуоресценция заметно разгорается. Это детектируется после каждого цикла ПЦР, таким образом, можно в реальном времени наблюдать за накоплением продукта.

Один из наиболее популярных приборов для проведения ПЦР в реальном времени – амплификатор CFX96 Touch производства компании Bio-Rad (рис. 67).

Рис.68. Зависимость относительного уровня флуоресценции от цикла ПЦР
Рис.68. Зависимость относительного уровня флуоресценции от цикла ПЦР

Данные накопления продуктов ПЦР представляются в виде графика, который состоит из базовой линии, экспоненциальной фазы и плато (рис. 68). На начальных этапах флуоресценция слабая, так как продукта мало, поэтому её трудно отличить от фона. По мере накопления продукта сигнал растёт сначала экспоненциально, а затем выходит на плато. Ключевой параметр в ПЦР в реальном времени – это пороговый цикл, представляющий собой значение количества циклов реакции, при котором кривая амплификации и прямая порога чувствительности прибора пересекаются. Номер порогового цикла обратно пропорционален концентрации ДНК в исходном образце. Для количественного определения ДНК необходимо построить калибровочную кривую, исходя из данных для образцов с известной концентрацией.

Метод ПЦР в реальном времени широко используется для диагностики инфекционных заболеваний, а также для определения вирусной нагрузки (например, у ВИЧ-инфицированных пациентов). Также метод ПЦР используется для исследования непосредственно клеток иммунной системы, в частности для HLA-типирования.

Один из видов ПЦР нашел применение в in vitro диагностике иммунодефицитных состояний. Для выявления дефектов того или иного звена иммунитета (гуморального или клеточного) применяется количественная мультиплексная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.

Рис.69. Молекулярные основы диагностики иммунодефицитов используя ПЦР.
Рис.69. Молекулярные основы диагностики иммунодефицитов используя ПЦР.

В процессе созревание Т- и В-лимфоцитов в тимусе и костном мозге происходит формирование клеточных рецепторов посредством рекомбинации генов в цепи эписомальной ДНК, с целью создания уникального участка, распознающего антиген. Во время каждой такой рекомбинации из цепи вырезается небольшой фрагмент, образующий эксцизионное кольцо. Эти кольца получили названия TREC (T-cell Receptor Excision Circle) и KREC (Kappa-deleting Recombination Excision Circle). TREC сопровождают созревание практически всех T-лимфоцитов, а KREC – всех В-лимфоцитов и, таким образом, служат маркерами их количества (рис.69). Методика позволяет судить о количестве Т- и В-лимфоцитов на основании измерения уровней TREC и KREC — побочных продуктов рекомбинации генов Т- и В-клеточных рецепторов. Снижение количества TREC и/или KREC в крови свидетельствует о наличии иммунодефицитных состояний.

Материалом для исследования может служить как цельная кровь, так и сухое пятно крови (в том числе собираемое в ходе национальной программы скрининга новорожденных).

Капельная цифровая ПЦР. Наиболее точным методом определения количества ДНК является капельная цифровая ПЦР (кцПЦР, ddPCR). В отличие от ПЦР в реальном времени, являющейся методом измерения относительного количества ДНК, кцПЦР – абсолютный количественный метод. Он позволяет определять количество копий ДНК в образце без необходимости построения калибровочных кривых. В основе кцПЦР лежит разделение пробы на тысячи капель (компартментов) и проведение ПЦР непосредственно в каждой капле. Определение количества ДНК проводят прямым подсчетом капель с наличием или отсутствием в них мишени, что существенно увеличивает стабильность системы и делает ее менее зависимой от эффективности ПЦР. Концентрация ДНК-мишени определяется в исходном образце в виде числа копий в микролитре с чувствительностью до 1 молекулы.

Рис.70. Система кцПЦР QX200 QX200 Droplet Digital PCR System. Ридер капель (слева) и генератор капель (справа).
Рис.70. Система кцПЦР QX200 QX200 Droplet Digital PCR System.
Ридер капель (слева) и генератор капель (справа).

Такая точность необходима при исследовании различных геномных изменений, таких как вариации числа копий генов (CNV) или однонуклеотидные замены (SNP). Эти генетические полиморфизмы являются одним из ключевых механизмов развития онкологических и других заболеваний, в том числе аутоиммунных. Анализ экспрессии гена HER2 и вариаций числа его копий гена является важнейшим этапом в диагностике и лечении рака груди. Точность применяемых стандартных методов иммуноцитохимии и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) составляет лишь 80%, тогда как кцПЦР – 99%. Кроме того, метод отлично работает со сложным образцами, такими как фиксированные в формалине парафинизированные (FFPE) ткани. кцПЦР позволяет обнаруживать до 0,01% минорного генома в присутствии генома нормальной ткани. Например, можно детектировать 1 копию генома вируса герпеса человека 6 типа (HHV-6) среди 1,7 миллионов копий геномов человека. Также с помощью данного метода можно определять точечные мутации в сложных образцах, например, однонуклеотидные замены в гене BRAF и других генах сигнального каскада RAS, обусловливающие развитие злокачественных опухолей.

На первом этапе при постановке кцПЦР готовится ПЦР-смесь с флуоресцентными зондами, меченными FAM и HEX (или VIC), или же с интеркалирующим красителем EvaGreen. Для этого используются только запатентованные реагенты, специально разработанные компанией Bio-Rad для генерирования капель.

На следующем этапе 20 мкл ПЦР-смеси, в которой требуется определить количество исследуемой ДНК, помещают в генератор капель и создают водно-масляную эмульсию. За счет системы микрофлюидики он разделяет реакционную смесь на 20 000 капель нанолитрового объема. В процессе генерации капель образуются капли одинакового размера, что обеспечивает высокоточный количественный подсчет мишеней (рис. 71).

Рис. 71. Процесс формирования одинаковых по размеру и объему капель.
Рис. 71. Процесс формирования одинаковых по размеру и объему капель.

Генетический материал распределяется по каплям случайным образом, по закону распределения малых чисел Пуассона

На следующем этапе эмульсия в планшете переносится в термоциклер для амплификации мишени. В тех каплях, куда попала ДНК-мишень, образуется ПЦР-продукт, что приводит к увеличению уровня флуоресцентного сигнала. Для расчета концентрации целевой ДНК после ПЦР образцы переносят в ридер, где осуществляется прямой подсчет капель с положительным или отрицательным флуоресцентным сигналом с помощью двухцветной системы определения (настроенной для определения FAM и HEX [или VIC]).  Капли, содержащие как минимум одну копию ДНК-мишени, дают повышенный флуоресцентный сигнал по сравнению с отрицательными каплями, в которых ДНК-мишени нет.

Далее программное обеспечение QuantaSoft™ подсчитывает количество положительных и отрицательных капель для каждого флуорофора в каждом образце и, применяя алгоритм вычисления функции распределения Пуассона, выдает концентрацию ДНК-мишени в виде числа копий в микролитре.

Секвенирование определении линейного порядка следования компонентов макромолекулы (аминокислоты в белке, нуклеотиды в ДНК и РНК, моносахариды в полисахаридах, и т.д.). В генетике, это процесс определения последовательности нуклеиновой кислоты — порядка нуклеотидов в ДНК четырех оснований: аденина, тимина, гуанина и цитозина в различных генах. Ген — это последовательность ДНК содержащий информацию о структуре белков, влияющих на формирования биохимических процессов в организме, является структурной и функциональной единицей наследственности. Непосредственно гены определяют нашу внешность, показатели здоровья, непереносимость продуктов и лекарств и пр.. Всего в геноме человека более 20 тысяч генов. Несмотря на то, что одни и те же гены есть у каждого человека, тем не менее они имеют варианты одного и того же гена (полиморфизм гена).

Отличие между мутациями и полиморфизмом довольно условно: когда один из вариантов нуклеотидных последовательностей участка ДНК выявляется более чем у 1 % людей в популяции и не приводит к развитию заболевания, это называется полиморфизмом, если же менее 1 % или с высокой вероятностью приводит к болезни — мутацией.

Полиморфизм в генах могут изменить структуру белков и повлиять на функциональные показатели. Определение первичной нуклеотидной последовательности ДНК является важным этапом молекулярно-генетических исследований, так как различия в нуклеотидном составе могут обуславливать изменения важных функциональных характеристик интересующих нас образцов. Так, отдельные однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), вариации копийности генов (CNV), делеции или инсерции (Indel) и структурные перестройки в ДНК могут быть причиной возникновения различных наследственных или аутоиммунных заболеваний. Анализ ДНК опухолевых клеток позволяет выявить степень злокачественности опухоли и подобрать необходимую персонализированную терапию. Важнейшее значение генетическим исследованиям принадлежит в диагностике первичных иммунодефицитов.

Один из ключевых методов определения первичной последовательности ДНК – секвенирование – был изобретен более 50 лет назад. За десятилетия интенсивного развития удалось разработать несколько поколений секвенаторов и сконструировать не один десяток моделей приборов.

В настоящее время выделяют три поколения секвенирования:

  1. Секвенирование по Сэнгеру
  2. Массово-параллельное секвенирование нового поколения (Next Generation Sequencing, NGS)
  3. Мономолекулярное секвенирование
  4. Секвенирование по Сэнгеру (или капиллярный электрофорез) является одной из первых разработанных технологий секвенирования, которая и по сей день остаётся золотым стандартом точности.

Данный метод основан на использовании модифицированных флуоресцентно меченных, так называемых «терминирующих» нуклеотидов.

На этапе пробоподготовки к исходной ДНК добавляются праймеры. При таргетном секвенировании используются праймеры только к интересующим участкам. Если необходимо исследовать всю ДНК, то добавляются рандомные праймеры. С этих праймеров начинается достраивание второй цепи ДНК в последующей реакции ПЦР. Кроме того, к ДНК добавляются нуклеотиды – избыток стандартных немеченых дезоксирибонуклеотидов (dNTP) и некоторое количество специальных «терминирующих» нуклеотидов. Терминирующие нуклеотиды представляют собой дидезоксирибонуклеотиды (ddNTP). Их особенность заключается в том, что после включения в растущую цепь ДНК они не позволяют присоединиться следующему нуклеотиду, то есть после присоединения ddNTP цепь обрывается. Соотношение dNTP и ddNTP подобрано таким образом, что для каждого фрагмента ДНК ddNTP встраивается в случайный момент, и после определенного количества циклов ПЦР образуются фрагменты всех возможных длин (рис.72).

Рис. 72. Секвенирование по Сэнгеру (или капиллярный электрофорез)
Рис. 72. Секвенирование по Сэнгеру (или капиллярный электрофорез)

После ПЦР с терминирующими нуклеотидами образуется смесь фрагментов всех возможных длин, отличающихся друг от друга на 1 нуклеотид. Разделение фрагментов по размеру происходит в длинном капилляре. Каждый цвет соответствует одному из четырех ddNTP на конце фрагмента ДНК.

Смесь фрагментов разделяется по своей массе в тонком длинном капилляре под действием электрического тока. Более короткие фрагменты двигаются быстрее, длинные – медленнее. В результате фрагменты выстраиваются в ряд по размеру с разрешением в один нуклеотид. При прохождении через дальний конец капилляра фрагменты облучаются лазерным лучом, и сигнал от разных флуоресцентных красителей фиксируется как определенный нуклеотид. Таким образом, зная нуклеотид, на котором оборвалась цепь ДНК при ПЦР, мы выстраиваем последовательность ДНК.

Кроме секвенирования в его классическом понимании, капиллярный электрофорез можно также использовать для фрагментного анализа, например, для исследования микросателлитных участков генома при идентификации личности. В таких анализах важно установить длину участков, а не их конкретную последовательность. Для этого флуоресцентно-меченные образцы направляются в капилляр одновременно с размерным стандартном, который мечен другим красителем. Длину фрагментов вычисляют путем сравнения с размерным стандартом.

Несмотря на высокую точность, секвенирование по Сэнгеру имеет ряд ограничений: низкую производительность (до 1200 нуклеотидов на 1 капилляр) и высокую стоимость исследования одного образца. Поэтому в настоящее время данная технология используется в основном для таргетного (целевого) секвенирования фрагментов ДНК с целью анализа мутаций и полиморфизмов в конкретных генах. (например, для типирования генов гистосовместимости человека (HLA) II класса), микросателлитного анализа и валидации данных, полученных на платформах секвенирования нового поколения (NGS).

NGS-секвенирование было разработано в начале XXI века с целью многократно увеличить производительность секвенаторов. Дело в том, что для анализа полного генома человека, как и любых других организмов, необходимо получить данные о миллионах нуклеотидов. Так, например, человеческий геном содержит более 3 млрд пар нуклеотидов, и для его оперативного анализа необходимы существенно более производительные методы, чем секвенирование по Сэнгеру.

Принцип NGS основан на одновременном секвенировании миллионов коротких (до 600 нуклеотидов) фрагментов ДНК, что дало ему название «массово-параллельное» секвенирование. Последующая специальная биоинформатическая обработка позволяет объединить данные последовательностей миллионов коротких фрагментов в длинную исходную цепь ДНК.

Технологический процесс NGS-секвенирования можно условно разделить на три этапа: подготовка библиотек, клональная амплификация и, непосредственно, само секвенирование.

На этапе подготовки библиотек исходная ДНК фрагментируется, и к фрагментам «пришиваются» адаптеры с известной последовательностью. Подобная смесь фрагментов ДНК, фланкированных адаптерами, называется библиотекой (Рис.73). Адаптеры служат сайтами посадки праймеров для дальнейших этапов амплификации фрагментов. В адаптеры также могут быть включены уникальные короткие последовательности, так называемые баркоды, для возможности одновременного (мультиплексного) секвенирования нескольких образцов за один запуск прибора.

Рис. 73. Этапы подготовки NGS-библиотек
Рис. 73. Этапы подготовки NGS-библиотек

Количество фрагментов, получаемых в ходе подготовки библиотек, обычно недостаточно для проведения этапа секвенирования, так как чувствительность прибора не позволяет работать с низкими концентрациями фрагментов ДНК. Поэтому после подготовки библиотек проводят клональную амплификацию полученных фрагментов, в ходе которой их количество увеличивается в тысячи раз.

Различные производители секвенаторов разработали свои собственные технологии клональной амплификации (Рис.74). В большинстве случаев для многократного увеличения количества фрагментов библиотеки используется метод ПЦР. ПЦР может проходить непосредственно на ячейке для секвенирования, либо в масляной эмульсии. В случае проведения ПЦР на проточной ячейке (Рис.74А) (технология Illumina), фрагменты библиотеки закрепляются на подложке благодаря взаимодействию с олигонуклеотидами, комплементарными адаптерным последовательностям (Рис.74А-1). В процессе так называемой «мостиковой ПЦР», или механизму «Golden Gate», в результате многократных циклов ПЦР, вокруг каждого исходного фрагмента библиотеки образуется кластер из одинаковых фрагментов. В ходе секвенирования к фрагментам кластеров присоединяются флуоресцентно-меченные нуклеотиды, и сигнал от кластера молекул уже может быть детектирован оптической системой секвенатора.

Рис. 74. Технологии клональной амплификации
Рис. 74. Технологии клональной амплификации

А) Подготовка библиотек на чипе – мостиковая ПЦР «Golden-gate», Illumina;

Б) Эмульсионная ПЦР, Ion Torrent, Thermo Fisher Scientific;

B) Линейная амплификация методом катящегося кольца, DNBSEQ, MGI.

Технология полупроводникового секвенирования Ion Torrent предполагает клональную амплификацию библиотек с помощью эмульсионной ПЦР. Фрагменты библиотеки помещаются в микроскопические капли масла вместе с компонентами ПЦР-реакции и специальными микросферами, покрытыми олигонуклеотидами (Рис.74Б).  В процессе ПЦР микросферы полностью покрываются клонально амплифицированными фрагментами библиотеки. В дальнейшем микросферы наносятся на специальный полупроводниковый чип с микролунками, и с одной микролунки считывается сигнал для одного фрагмента библиотеки.

ПЦР является стандартным методом быстрого увеличения количества ДНК, однако у данного метода есть несколько недостатков, основной из которых – клональное накопление ошибок ДНК-полимеразы. Так как в каждом цикле вновь синтезированная ДНК служит матрицей для новых фрагментов, любая ошибка фермента будет копироваться в следующий фрагмент и накапливаться в геометрической прогрессии. Это затрудняет дальнейший анализ, так как не всегда очевидно, является ли найденный вариант истинной мутацией или ошибкой ПЦР. Проблема частично решается биоинформатической обработкой или добавлением специальных молекулярных индексов, с помощью которых метят каждую исходную молекулу ДНК. Однако, данные манипуляции увеличивают время и стоимость анализа.

Инновационный подход к решению проблемы клонального накопления ошибок применяется в технологии DNBSEQ, MGI (Рис.74B). После лигирования адаптеров ДНК денатурируется до одноцепочечного состояния, и в реакцию добавляется олигонуклеотид, частично комплементарный обеим адаптерным последовательностям. В итоге фрагмент замыкается в одноцепочечное кольцо. На следующем этапе к кольцевым фрагментам добавляется специальная полимераза phi29, которая начинает по кругу достраивать вторую цепь ДНК. В какой-то момент полимераза наталкивается на участок, который она же сама синтезировала на предыдущем круге. Однако, благодаря хеликазной активности, phi29 не соскакивает с ДНК, а расплетает цепи и продолжает синтез второй цепи на исходной матрице. Подобный процесс называется линейной амплификацией по принципу «катящегося кольца». В результате многократных циклов формируется длинная одноцепочечная нить ДНК, состоящая из одинаковых повторов исходного фрагмента. Главным преимуществом такого метода является то, что полимераза в каждом цикле копирует исходную матрицу, и клональное накопление ошибок отсутствует. На следующем этапе за счет смены рН и ионной силы в растворе, одноцепочечная нить компактизируется до клубка, так называемого «наношарика» (DNA nanoball, DNB). Наношарики наносятся на проточную ячейку, где присоединяются к специальным заряженным зонам за счет электростатического взаимодействия. Секвенирование происходит путем детекции флуоресцентных меток на встраиваемых нуклеотидах.

Разные технологии секвенирования различаются между собой способом детекции нуклеотидов. Так, например, в технологиях DNBSEQ (MGI) и Illumina нуклеотиды мечены флуоресцентными красителями, и прибор в каждом акте секвенирования детектирует цвет нуклеотида, который в данный момент встраивается в растущую цепь ДНК. После встраивания очередного нуклеотида флуоресцентный краситель отщепляется, и может быть встроен следующий нуклеотид. Другие методы основаны на детекции различных продуктов реакции в ходе синтеза второй цепи ДНК на исходной матрице. Так, например, технология Ion Torrent (Thermo Fisher Scientific) предполагает детекцию протонов, высвобождающихся в процессе присоединения нуклеотида к растущей цепи ДНК. Секвенирование происходит на микрочипах в специальных лунках, к каждой из которых присоединён микро-рН-метр. Разные нуклеотиды подаются на чип последовательно и, в случае присоединения нуклеотида к растущей цепи, возникает локальный скачок рН, который фиксируется прибором. Скачок рН, увеличенный вдвое, означает, что присоединилось два нуклеотида подряд.

Длина фрагментов, получаемая при NGS-секвенировании, как правило, не превышает 600 нуклеотидов. Для выстраивания исходной последовательности ДНК миллионы коротких фрагментов биоинформатически собираются в группы и выравниваются на референсный геном (сравниваются со среднестатистическим «нормальным» геномом). Отличия от референса изучаются как потенциально значимые биомаркеры. В случае исследования экзотических живых организмов, для которых ранее не проводилось секвенирование, проводят так называемое секвенирование de novo. В этом случае сборку фрагментов производить сложнее, поэтому для таких задач желательно использовать максимально длинные прочтения.

Современные приборы позволяют получать сотни миллионов коротких прочтений за один запуск. Для достоверного анализа полного генома человека принято проводить секвенирование с тридцатикратным покрытием, то есть каждый нуклеотид генома должен быть прочитан минимум 30 раз (30х). Такое покрытие позволяет избежать ошибок и с достаточной степенью точности выявлять герминативные мутации.

Таким образом, для анализа полного генома человека нужно 30 раз отсеквенировать 3 млрд нуклеотидов, то есть, суммарно получить данные о 90 млрд нуклеотидов. Если длина одного прочтения секвенатора – 300 нуклеотидов, то для получения необходимого количества данных нужно сделать 300 млн прочтений.

Общее количество нуклеотидов, прочитанных за запуск секвенатора, называется выходом секвенирования, или производительностью, и обычно измеряется в Гигабазах (Гбаз = 1 млрд нуклеотидов).

Выбор той или иной технологии и модели секвенатора зависит от конкретной исследовательской задачи. Так, для исследований транскриптома или крупных перестроек в геноме (например, поиск трисомий плода в образцах крови матери, НИПТ) достаточно использовать малые модели секвенаторов с короткими длинами прочтения (50 нуклеотидов). Для анализа образцов смешанных микробных сообществ (метагеном), или секвенирования de novo, наоборот требуются длинные прочтения (более 300 нуклеотидов).

Различные модели NGS-секвенаторов различаются между собой производительностью, длинами прочтения, скоростью и стоимостью секвенирования (рис.75).

Рис. 75. Модельный ряд NGS-секвенаторов DNBSEQ (MGI).
Рис. 75. Модельный ряд NGS-секвенаторов DNBSEQ (MGI).

А) DNBSEQ-G50. Выход до 150 Гбаз, длина прочтений до 150 нуклеотидов, приложения: таргетное секвенирование, секвенирование малых геномов (например, бактерий), репродуктивная генетика;
Б) DNBSEQ-G400. Выход до 1440 Гбаз, длина прочтений до 400 нуклеотидов, приложения: полноэкзомное, полногеномное секвенирование;
В) DNBSEQ-T7. Выход до 6000 Гбаз, длина прочтений до 150 нуклеотидов, приложения: полногеномное секвенирование

Области применения NGS-секвенирования очень разнообразны. Благодаря низкой стоимости данных в пересчете на один образец и высокой производительности, NGS становится рутинным методом как в медицинских исследованиях (поиск биомаркеров онкологических и наследственных заболеваний, репродуктивная генетика), так и в сельском хозяйстве и биотехнологии (генотипирование сельскохозяйственных животных и растений, поиск генов устойчивости к неблагоприятным условиям среды и маркеров качества).

В иммунологических исследованиях NGS широко применяется для глубокого анализа индивидуального разнообразия репертуаров антител и Т-клеточных рецепторов (клональность лимфоцитов), высокопроизводительного HLA-типирования и полногеномного анализа для изучения аутоиммунных и наследственных заболеваний.

Мономолекулярное секвенирование отличается от других платформ исключительно большой длиной прочтений (до 100 тысяч оснований). Определение последовательности ДНК происходит в реальном времени и может быть проанализировано ещё во время работы секвенатора (рис.76).

Рис. 76. Принцип мономолекулярного секвенирования
Рис. 76. Принцип мономолекулярного секвенирования

Самая широко используемая технология мономолекулярного секвенирования на данный момент – это нанопоровое секвенирование (Oxford Nanopore). При нанопоровом секвенировании молекулы ДНК под воздействием электрического поля проходят через специальные белковые нанопоры, закрепленные на билипидной мембране. При этом изменяется ток ионов через поры. В зависимости от нуклеотидной последовательности, которая в данный момент проходит через пору, ток изменяется на разную величину, и по графику изменения силы тока можно сделать вывод о нуклеотидной последовательности.

Данная технологи позволяет получать прочтения длиной в десятки тысяч нуклеотидов, что делает её незаменимой для de novo сборки геномов. Однако существенным недостатком на данный момент является высокий процент ошибок – до 10%, то есть ошибка встречается в каждом десятом нуклеотиде. Для получения корректных данных рекомендуется комбинировать данные длинных нанопоровых прочтений с высокоточными данными NGS-секвенирования.

Методы исследования метаболизма клеток.

Развитие иммунного ответа, проявление различных заболеваний, созревание и репрограммирование клеток имеют под собой единую фундаментальную основу, а именно, изменение показателей клеточного метаболизма (см.главу 1). Лабораторные исследования позволяют выявить вклад различных метаболических путей, а именно глюколиза, пентозофосфата, окисления жирных кислот, глутаминолиза, цикла Кребса и окислительного фосфорилирования, в модуляции врожденных и адаптивных иммунных клеток на основе их состояния активация/дифференцировка. Используя анализатор Seahorse XF можно, одновременно измеряет показатели двух основных путей получения клеточной энергии: митохондриального дыхания и гликолиза (рис.77).

Измерение гликолиза происходит за счет ECAR (Extracellular Acidification Rate) – измерение скорости внеклеточного закисления. В процессе гликолиза клетки генерируют АТФ без участия кислорода с побочными продуктами в виде лактата и протонов водорода. XFp Analyzer фиксирует показатели внеклеточного закисления протонами, тем самым оценивая интенсивность процессов гликолиза в клетках.

Митохондриальное дыхание оценивается за счет OCR (Oxygen Consumption Rate) – измерение скорости поглощения кислорода. Митохондрии поглощают кислород в процессе синтеза АТФ с помощью митохондриального дыхания. Этот путь является наиболее оптимальным для получения максимального количества энергии. XFp Analyzer оценивает интенсивность митохондриального дыхания, фиксируя скорость поглощения клетками кислорода.

XFp Analyzer использует специальные транзиентные микрокамеры, позволяющие с высокой точностью и чувствительностью проводить метаболические исследования в считанные минуты. Возможность автоматического добавления до 4-х веществ в реакционную среду делает XFp Analyzer идеальным инструментом для тестирования препаратов, подбора эффективной дозы и цитотоксических исследований в различных научных и медицинских приложениях.

Рис. 77. Схема биоанализатора Seahorse XF.
Рис. 77. Схема биоанализатора Seahorse XF.

А. Картридж датчика.
Б. Микропланшет для культивирования клеток.
B. Зонд с 4 портами для добавления любых соединений, и датчиками измерения уровня кислорода и pH раствора.

Биолюминесцентный анализ применим при оценке различных физиологических и патологических состояний человека, связанных с изменением интенсивности и направленности обменных процессов в организме, отдельных его системах. Определение метаболических параметров возможно в цельной крови и в ее составляющих (сыворотке крови или плазме, в эритроцитах, тромбоцитах, лейкоцитах, лимфоцитах), плевральном экссудате, спинномозговой жидкости. Возможна разработка методик для любого биологического материала. Метод основан на использовании биолюминесцентного определения активности ряда ферментов, их кофакторов и субстратов. В настоящее время разработаны методики для определения следующих метаболических параметров: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа;

Глава 9. Молекулярно-генетические исследования в иммунологииглицерол-3-фосфатдегидрогеназа; лактатдегидрогеназа (прямая и обратная реакция); малатдегидрогеназа (прямая и обратная реакция); малик-фермент (НАДФ-зависимая декарбоксилирующая малатдегидрогеназа); НАДФ-зависимая глутаматдегидрогеназа (прямая и обратная реакция); НАД-зависимая глутаматдегидрогеназа (прямая и обратная реакция); НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа; НАДФ-зависимая изоцитратдегидрогеназа; глутатионредуктаза;

пируватдегидрогеназный комплекс; 2-оксоглутаратдегидрогеназный комплекс; АТФ; малат; пируват; лактат; глюкозо-6-фосфат; НАД и НАДФ.

Для исследований применяется биоферментный комплекс из светящихся бактерий, производимый в Институте биофизики ФИЦ КНЦ СО РАН. Определение вышеперечисленных параметров проводится на биолюминометрах, выпускаемых СКТБ «Наука» ФИЦ КНЦ СО РАН. Для проведения анализа используются микроколичества биологического материала.

Доказана информативность и прогностическая значимость метаболических показателей при оценке влияния экологических (климатических и антропогенных) факторов на организм человека, для выделения групп риска по заболеваниям дыхательных путей и ЛОР-органов, для диагностики метаболической иммунодепрессии при таких заболеваниях как ЧДБ ОРЗ, отиты, бронхиты, пневмонии, гепатиты, герпес-инфекции, грибковые и паразитарные инфекции. Определена необходимость тестирования метаболического состояния лимфоцитов крови при таких заболеваниях у детей как атопический дерматит и респираторные аллергозы. Оценка метаболического состояния лимфоцитов крови при вышеперечисленных заболеваниях позволяет более обосновано и корректно назначать медикоментозные средства, контролировать процесс лечения и выздоровления. В случае хронических заболеваний с помощью метаболических параметров возможно осуществлять прогноз время наступления и длительность ремиссии.

Хемилюминесцентный метод. Уровень хемилюминесценции при фагоцитозе характеризует интенсивность «респираторного взрыва» в клетках с продукцией активных форм кислорода, оказывающих бактерицидное действие. Первичные метаболиты активированного кислорода представляют собой супероксидный анион-радикал (О2-), перекись водорода (Н2О2), гидроксильный радикал (НО2), синглетный кислород (О2). В качестве основных вторичных метаболитов необходимо отметить гипохлорную кислоту (HClO), хлорамины и продукты перекисного окисления липидов. Взаимопревращения первичных и вторичных оксидантов с мощным энергетическим потенциалом создают динамический спектр молекул, которые прямо или косвенно вовлекаются в реакции фагоцитов. При этом взаимодействие высокоэнергетических оксидантов с люминесцирующими посредниками (люминол, люцигенин и др.) приводит к переходу последних в электронно-возбужденное состояние, выход из которого сопровождается испусканием кванта света. Регистрация светоизлучения хемилюминесцентной реакции производится на хемилюминометрах отечественного или зарубежного производства. В частности, на биохемилюминесцентном анализаторе БЛМ-3607, который выпускается ООО «МедБиоТех» (г. Красноярск, Россия). Механизм хемилюминесценции лейкоцитов зависит от природы стимулирующего агента, отличаясь своей специфичностью. Доказана высокая степень корреляции между уровнем хемилюминесценции фагоцитов и киллингом, поэтому определение хемилюминесценции лейкоцитов может использоваться как один из критериев их способности к завершенному фагоцитозу, позволяющих оценить функциональную активность лейкоцитов.

НСТ-тест. Восстановление НСТ в фагоцитозе прямо зависит от эффективности метаболических процессов в клетке. Интенсивность восстановления отражает активность генерации супероксидных радикалов. Этот метод является чувствительным индикатором раздражения клеток (спонтанный НСТ) и их функциональных резервов (стимулированный НСТ). В норме число НСТ-положительных нейтрофилов составляет 10 % (или 50–130 у.е.), после стимуляции – 40–80 % (80–200 у.е.).

 

вверх

Заказать обратный звонок