Определяя клинический иммунологический диагноз, мы тем самым выделяем определенный иммунотип в формировании заболевания. Иммунотипы (эндотипы иммунного ответа) это кластеры клинических компонентов заболевания (физиологические, иммунологические, патологические, генетические признаков, ответ на лечение и другие) которые в совокупности формируют фенотип заболевания. Однако наиболее важно ответить на вопрос какие конкретно нарушения имеются у иммунной системы. Учитывая сложность и многокомпонентность организации иммунной системы (клеточный/гуморальный, мукозальный/врожденный/ адаптивный иммунитет) необходимо точечная, топическая диагностика. Топическая диагностика (по аналогу определения в неврологии) – определение локализации и распространенности нарушений иммунной системы на основании выявленных при комплексном обследовании нарушений иммунной системы. Учитывая, что основная структурная и функциональная единица иммунной системы клетка, основной акцент на выявление нарушений функции иммунитета стоит сфокусировать на исследовании клеток иммунной системы и эффекторных и регуляторных молекулах. В настоящее время с помощью проточной цитометрии возможно дифференцировать практически любые виды клеток определить их функциональную активность. Однако в связи с тем, что основная масса клеток иммунной системы находится в ткани и их исследования в отличии от периферической крови имеют технические сложности требуется дополнительные разработки по клинической оценки топической диагностики иммунных нарушений. Тем не менее существующие методы исследования позволяют выявить нарушения в том или ином звене иммунитета. Не менее важным является оценка и гуморальных факиров иммунитета. Суммарно с позиций физиологии иммунный ответ возможно разделить на 3 этапа (рис.89). Именно с этих позиций необходимо проводить и топическую диагностику.

Эффекторный ответ основной функциональный продукт иммунной системы. Наиболее простые и достаточно информативные методы заключаются в определении концентрации иммуноглобулинов, специфических АТ и других показателей, характеризующих состояние гуморального звена иммунной системы. Наибольшее распространение в определении различных гуморальных показателей иммунитета получил метод иммуноферментного анализа (ИФА).

Определение уровня иммуноглобулинов – это по-прежнему важный и надежный метод оценки иммунитета. Его можно считать главным методом диагностики всех форм иммунодефицитов, связанных с биосинтезом АТ. Лабораторным методом можно определить не только уровни концентрации иммуноглобулинов G, A, Е и M в сыворотке крови, но и субклассы иммуноглобулинов, особенно IgG, секреторного IgA, соотношения каппа (ϰ)- и лямбда (λ)-цепей. Нормативные показатели зависят от возраста исследуемого (табл.42)

Нормативные показатели уровня иммуноглобулина

Изменения концентрации иммуноглобулинов служат подтверждением гуморально-ассоциированной иммунопатологии. Снижение такой концентрации в сыворотке крови больных может свидетельствовать о различных патологиях– от генетических дефектов синтеза иммуноглобулинов до транзиторных состояний, связанных с потерей белка организмом (гуморально-эффекторный иммунодефицит). Повышение концентраций относительно нормативных значений говорит о наличии аллергических, аутоиммунных процессов (АТ-зависимая цитотоксичность), оно характерно для инфекционных заболеваний на определенных этапах их развития (увеличение IgM в острый период заболевания и/или обострения хронической инфекции, IgG в стадии разрешения и/или формирования хронической инфекции). Кроме того, указанный метод является критерием эффективности проводимого лечения, в том числе заместительной терапии иммуноглобулинсодержащими препаратами.

Определение субклассов IgG представляет диагностическую ценность, так как при нормальном его уровне могут быть дефициты по субклассам иммуноглобулинов. У таких людей в ряде случаев наблюдаются иммунодефицитные состояния, проявляющиеся в повышенной частоте инфекционной заболеваемости. Так, IgG2 – субкласс иммуноглобулина G, который преимущественно содержит АТ против полисахаридов инкапсулированных бактерий (Haemophiluls influlenzae, Steptococculs pneumoniae). Поэтому дефицит, связанный с IgG2, а также с IgA, ведет к повышенной заболеваемости респираторными инфекциями. Нарушения в соотношении субклассов IgA и в соотношении каппа (ϰ)- и лямбда (λ)-цепей также могут быть причиной иммунодефицитных состояний.

Уровни сывороточных иммуноглобулинов, характерные для взрослых (IgM, IgG1, IgG3), достигают нормальных значений уже в раннем постнатальном периоде. Концентрации IgG2, IgG4, IgA не достигают нормы даже в период полового созревания. Распределение субклассов IgG в сыворотке крови взрослого человека следующее: IgG1 – 60–65 %; IgG2 – 20–25 %; IgG3 – 10–20 %; IgG4 – 10–20 %. Наиболее часто у больных имеется ассоциация дефицитов IgG2, IgG4, IgA, IgE.

Определение уровня субклассов IgG существенно при повышенной чувствительности к бактериальным инфекциям. Дефициты установлены практически для всех иммуноглобулинов, где наиболее значимым будет дефицит IgG2, который часто сочетается с полным отсутствием IgA.

Определение специфических антител. Важную информацию о состоянии гуморального иммунитета дает определение АТ к различным АГ, так как степень защиты организма от данной конкретной инфекции зависит не от общего уровня иммуноглобулинов, а от количества специфических АТ к ее возбудителю. В настоящее время существует большое количество тест-систем по распознаванию уровня АТ к бактериальным, вирусным, грибковым инфекциям и инвазиям. Нет необходимости их перечислять. Спектр определения в большинстве случаев зависит от того, какие тест-системы имеются в лаборатории.

Особо важное значение имеют эти исследования при инфекциях, повреждающие иммунную систему – вирус иммунодефицита человека, вирус Эпштейна-Барр, герпесвирус человека (табл.43), онкогенных вирусах, при диагностике эритем (табл.44).

Герпесвирусные инфекции

Диагностика эритем

Большое значение определение АТ имеет диагностика хронических инфекций и инвазий в т.ч. сифилиса, туберкулеза, токсоплазмоза, бруцеллёза и пр.

Аутоиммунный процесс может диагностироваться у больных при обнаружении в сыворотке крови тех или иных аутоантител. В противном случае аутоиммунный генез заболеваний может быть исключен, что окажет существенное влияние на ход дальнейших исследований и тактику лечения. Нахождение в сыворотке крови АТ к нативной и денатурированной ДНК проводится также методом ИФА на твердофазном носителе (пластике). ДНК как АГ сорбирована на пластике, с этим АГ специфически взаимодействуют аутоантитела к ДНК, содержащиеся в исследуемой сыворотке (табл.45).

Профили аутоантител для диагностики аутоиммунных заболеваний

Выявление аутоантител к нативной и денатурированной ДНК имеет диагностическое значение при системных заболеваниях соединительной ткани, активных воспалительных процессах, хронических гепатитах, инфекционном эндокардите и других заболеваниях, сопровождающихся аутоиммунными процессами. Наличие аутоантител к ДНК при различных заболеваниях наряду с клиническими проявлениями может служить доказательством аутоиммунного процесса и служит базой для диагностики аутоиммунных заболеваний и васкулитов (табл.45, 46).

Профили аутоантител для диагностики васкулитов

Тестирование аутоантител проводится для подтверждения диагноза у больных с недостаточным числом клинических проявлений. Обнаружение аутоантител при отсутствии клинических признаков не является основанием для постановки диагноза аутоиммунного заболевания, т.к. выявления аутоантител наблюдается у лиц пожилого и старческого возраста, на фоне приема лекарственных препаратов, при вирусных и бактериальных инфекциях, злокачественных новообразованиях. Для аутоиммунных заболеваний характерно наличие нескольких типов аутоантител (профиль аутоантител), которые увеличивает диагностическую ценность маркеров.

Помимо аутоантител на развитие аутоиммунного заболевания косвенно будут указывать неспецифические нарушения иммунитета (гипериммуноглобулинемия, снижение концентрации комплемента, увеличение альфа-интерферонов и пр.).

В аллергологии имеет важное значение определение общего уровня IgE. Увеличение общего уровня IgE — подтверждение атопического развития не только аллергии, но и любого воспалительного процесса. Существенно для диагностики синдрома гипер-IgE, полезно для дифференциальной диагностики атопических заболеваний наряду с IgG4. Одним из наиболее информативных и безопасных для больного методов диагностики атопического процесса – выявление в сыворотке крови аллергенспецифических АТ IgE-класса, а также субкласса IgG4.

Одним из наиболее информативных и безопасных для больного методов диагностики атопического процесса – выявление в сыворотке крови аллергенспецифических АТ IgE-класса, а также субкласса IgG4. Определение аллергенспецифических АТ IgE-класса в сыворотке крови проводится методом неконкурентного непрямого твердофазного ИФА с использованием поликлональных и моноклональных анти-IgE-АТ, входящих в пероксидазный конъюгат, который способен выявлять в сыворотке крови больных аллергией АТ IgE-класса, афинно взаимодействовать с аллергенами, сорбированными на полистироловой поверхности (может быть использована пробирка, плашка или шарик). Принцип метода основан на способности белка неспецифически прилипать к пластику, особенно к полистиролу. Для этого метода характерна высокая чувствительность и специфичность.

В последнее время в клиническую практику для диагностики аллергий вошел метод мультиплексного твердофазного иммунофлуоресцентного исследования специфических антител класса IgE с использованием технологии биочипов — ImmunoCAP ISAC. Он позволяет определить специфические антитела к отдельным молекулярным компонентам аллергена, включая специфические и кросс-реагирующие молекулярные структуры, что значительно повышает информативность обследования и позволяет выявить причину перекрестных реакций. Алгоритм диагностики подразумевает, используя тесты Phadiatop (взрослым и детям старше 4 лет) и Phadiatop infant (детям до 4 лет) определить аллергическую природу заболевания, а затем использовать другие тесты (панели аллергенов). Определяются специфические IgE не к наиболее распространенным пищевым, пыльцевым, эпидермальным аллергенам, аллергенам плесневых грибов и насекомых, а к аллергокомпонентам.

Например, у коровьего молока и яичного белка их определяется 4 (овомукоид, овальбумин, кональбумин/ овотрансферин, ливетин/ сывороточный альбумин) у тимофеевки 8 у креветки 3. Некоторые молекулярные компоненты встречаются в разных аллергенах. Например, PR-10 протеин имеет береза, ольха, орешник, фундук, яблоко, персик, соевые бобы, арахис, киви, сельдерей. Профилин – береза, латекс, пролесник. Этим и обусловлены перекрестные аллергические реакции. Поэтому тест рекомендуется, когда история болезни и анализ истории болезни показывают: поливалентную аллергию (аллергия на несколько источников аллергенов), подозреваются перекрестные реакции. Результат теста определяет индивидуальный профиль сенсибилизации (рис.90).

Одни из важнейших эффекторных молекул гуморального иммунитета белки системы комплемента. Центральными компонентами которого является компоненты С3 и С4. (табл.47).

Нормативные показатели в диагностики патологии системы комплемента

Определение общей гемолитической способности комплемента (CH-50) позволяет выявить большинство нарушений этой системы. При наследственной недостаточности компонентов от С1 до С8 показатель СН50 приближен к нулю, а при недостаточности С9 он составляет примерно половину от нормы. При приобретенной недостаточности комплемента показатели СН50 зависят от характера и тяжести основного заболевания. Анализ не выявляет недостаточности факторов альтернативного пути и лектинового пути активации комплемента.

Компонент комплемента С3 —белок острой фазы воспаления, важнейшая часть защиты от инфекций. Он образуется в макрофагах и фибробластах, печени лимфоидной ткани и коже, составляет около 70% всех белков системы комплемента.

С3 компонент комплемента участвует как в классическом, так и в альтернативном пути активации системы комплемента (см. главу 3). Скорость синтеза приблизительно 1 мг/кг массы тела за один час. Скорость катаболизма — примерно 2% всего его объёма в плазме за один час, полупериод жизни 60 — 80 часов. Активация С3 способствует выделению гистамина из тучных клеток и тромбоцитов, поддерживает фагоцитоз, усиливает проницаемость стенок сосудов, усиливает сокращение гладкой мускулатуры, хемотаксис лейкоцитов и соединение антител с антигеном; играет важную роль в развитии аутоиммунных заболеваний. Содержание С3 снижается вследствие его потребления при классическом и альтернативном пути активации системы комплемента.

Компонент комплемента С4 участвует только в классическом пути активации системы комплемента, имеет важное значение в развитии аутоиммунных заболеваний.

С1-ингибитор, связанный с количественной недостаточностью или сниженной активностью – один из наиболее частых врожденных дефектов системы комплемента. Он служит причиной наследственного ангионевротического отека, который проявляется повторными эпизодами сосудистого отека, захватывающего подслизистый слой дыхательных путей, пищеварительного тракта и подкожную клетчатку. Наиболее опасным является отек гортани. В большинстве случаев заболевание манифестирует в детстве, реже – во взрослом состоянии.

Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) образуются при взаимодействии АГ и АТ в крови. В норме они выводятся системой мононуклеарных фагоцитов. При избыточном формировании иммунных комплексов и их неэффективной элиминации может возникнуть болезнь иммунных комплексов (гиперчувствительность III типа).

Антитела к C1q-фактору приводят к снижению уровня C1q в крови, способствуют образованию иммунных комплексов, которые, в свою очередь, откладываются в тканях и нарушают их функцию. Наличие антител к C1q напрямую связано с болезнью иммунных комплексов (васкулиты, аутоиммунные болезни, заболевания почек).

Нарушение функции комплемента подозревают во всех случаях рецидивирующего отека Квинке, аутоиммунных заболеваний, хронического нефрита или сегментарной липодистрофии, а также при частых гнойных инфекциях, диссеминации менингококковой или гонококковой инфекции и повторной бактериемии у больных любого возраста.

Не менее важным является оценка клеточного компонента эффекторного ответа. Однако в отличии от гуморального звена иммунитета сделать это достаточно сложно т.к. основное количество клеток иммунной системы находятся в тканях и прежде всего в слизистых и коже (барьерные органы). Тем не менее с помощью проточной цитометрии возможно определить даже малые популяции клеток, которые свидетельствуют об активности или недостаточности той или иной популяции клеток.

Для первого этапа топической диагностики возможно использовать стандартизованную технологию «Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови с применением проточных цитофлюориметров-анализаторов». Первоначальный проект данного документа был опубликован в журналах: «Медицинская иммунология» (2012, Т.14, №3, с.255-268) и «Проблемы стандартизации в здравоохранении» (2012, №5-6, с.28-44). После обсуждения на научных и научно-практических мероприятиях различного уровня, проводимых Всероссийским научно-практическим обществом по клинической лабораторной диагностике, Российским научным обществом иммунологов, а также в интернете на специализированном портале «Аллергологи-Иммунологи» (www.allergologi-immunologi.ru) был одобрен Профильной комиссией по клинической лабораторной диагностике Министерства Здравоохранения России 18.03.2014 г. и является руководством для проведения подобных исследований. В качестве нормативных показателей на территории Российской федерации применяют значения, полученных Хайдуковым С.В. и соавторами (табл. 48).

Относительное и абсолютное содержание основный популяций лимфоцитов в периферической крови условно здоровых добровольцев (возраст – 17-50 лет).

Большое значение при этом принадлежит определению абсолютного числа клеток т.к. именно их снижение или увеличение имеют клиническую значимость. Изменение относительного числа популяций клеток в большей степени свидетельствует о дисбалансе и требует обязательного перерасчета на абсолютное количество.

Особое внимание при проведении иммунофенотипирования следует уделить подсчету контрольных сумм, характеризующих качество и достоверность проведенного исследования. Пожалуй, главной из них является сумма Т-, В- и НК-клеток, которая должна находиться в пределах 100% (100% ± 5%). Например, Т-лимфоциты составляют 69,23%, В-лимфоциты – 8,29%, натуральные киллеры – 22,76%. При помощи нехитрых подсчетов контрольная сумма будет равна 100,28%, что полностью соответствует нормативным значениям. Еще одним «внутренним» контролем может являться то положение, что сумма Т-хелперов, выделенных при помощи CD3 и CD4, и цитотоксических Т-клеток с фенотипом CD3+CD8+ должна равняться общему числу CD3-позитивных клеток ± 5%. Хотя даже в рамках приведенных выше рекомендаций допускается расхождение не более 10% из-за присутствия в образце γdТ-клеток (увеличение числа дважды-негативных клеток в образце, что сопровождается уменьшением суммарного показателя Т-лимфоцитов) или наличия большого числа клеток, ко-экспрессирующих CD4 и CD8. В последнем случае сумма CD3+CD4+ и CD3+CD8+ может существенно превосходить общее число CD3+ клеток и выходить за прописанные в рекомендациях нормативы. Клиническая значимость этих параметров в настоящее время обсуждается при широком круге патологических состояний.

Однако для топической диагностики клеточного звена иммунитета стандартного исследования недостаточно. Используя проточную цитометрию возможно более детально охарактеризовать патологию клеток.

К эффекторным клеткам традиционно относят гранулоциты, часть лимфоидных клеток врожденного иммунитета, популяции ЦТЛ, γδ-Т- и В-лимфоцитов.

Гранулоциты составляют большинство лейкоцитов в периферической крови и преобладают в областях воспаления. Ключевыми клетками в развитии воспаления являются нейтрофилы, которые являются высоко реактивными клетками врожденного иммунитета, способными быстро мобилизоваться в очаг воспаления. За счет широкого спектра рецепторов нейтрофильные гранулоциты являются очень чувствительными клетками к изменению гомеостаза организма.

В клинической практике возможно оценивать эти клетки морфологически (юные, палочко-, сегментоядерные нейтрофилы). Однако используя проточную цитометрию по набору клеточных маркеров возможно оценить функциональную активность и степень зрелости нейтрофилов. Так наличие большого количества нейтрофилов с экспрессией на поверхности CD15 и CD11b свидетельствует о нарушении дифференцировки нейтрофилов, наоборот — CD16, CD64 свидетельствуют об активации нейтрофилов. (рис.73). Снижение экспрессии CD62L, CD50 позволяют выявить, дефекты миграции. Наличие на нейтрофилах HLA-DR свидетельствует о способности нейтрофилов к презентации АГ.

Одним из проявлений функциональной активности нейтрофилов является спонтанная и индуцированная люминол- и люцигенин-зависимая хемилюминесценция. Основные нормативные показатели которой представлены в таблице 49.

Количественный анализ базофилов и эозинофилов их клиническое значение описано выше (глава 6). Однако при топической диагностике заболеваний связанных с дегрануляцией базофилов хотелось бы выделить базофильный тест.

Базофильный тест основан на выявлении маркера активации базофилов (CD203) под действием исследуемого аллергена in vitro методом проточной цитофлуориметрии. Исследование проводится в короткие сроки, абсолютно безопасен для пациента. В качестве аллергена можно использовать любые вещества в том числе лекарственные средства (наибольшее применение нашли препараты для местной анестезии и контрастные вещества). На настоящий момент базофильный тест является основным тестом клеточной диагностики, используемым для обследования пациентов с аллергическими заболеваниями за рубежом. Перспективным для травматологов и стоматологов является такие исследования по прогнозированию отторжения инплантов.

Хемилюминесцентный анализ

Одним из проявлений функциональной активности нейтрофилов является спонтанная и индуцированная люминол- и люцигенин-зависимая хемилюминесценция. Основные нормативные показатели которой представлены в таблице 49.

Количественный анализ базофилов и эозинофилов их клиническое значение описано выше (глава 6). Однако при топической диагностике заболеваний связанных с дегрануляцией базофилов хотелось бы выделить базофильный тест.

Базофильный тест основан на выявлении маркера активации базофилов (CD203) под действием исследуемого аллергена in vitro методом проточной цитофлуориметрии. Исследование проводится в короткие сроки, абсолютно безопасен для пациента. В качестве аллергена можно использовать любые вещества в том числе лекарственные средства (наибольшее применение нашли препараты для местной анестезии и контрастные вещества). На настоящий момент базофильный тест является основным тестом клеточной диагностики, используемым для обследования пациентов с аллергическими заболеваниями за рубежом. Перспективным для травматологов и стоматологов является такие исследования по прогнозированию отторжения инплантов.

Хемилюминесцентный анализ

Натуральные киллеры (NK-клетки). В настоящее время для локализации NK-клеток в периферической крови наиболее широко используют анализ экспрессии CD16 и CD56, конъюгированных с одним и тем же флуорохромом, на CD3-негативных клетках.
Нормативные показатели представлены в таблице 50. Данная комбинация моноклональных антител позволяет локализовать общую популяцию NK-клеток количественно, но не охарактеризовать их отдельные субпопуляции. Кроме того, у такого подхода есть чисто практическое значение, позволяющее упростить процедуру идентификации NK-клеток в клинической практике. Как известно, НК-клетки способны

индуцировать апоптоз в клетках-мишенях, которые инфицированы вирусами и другими внутриклеточными антигенами, или же являются собственными «перерожденными» опухолевыми клетками, а также другие клетки аллогенного и ксеногенного происхождения (реакции отторжения трансплантата, например). Именно поэтому клиническая значимость определения NK-клеток при реакциях врожденного иммунитета, направленных на элиминацию внутриклеточных патогенов, не вызывает сомнений. Так, увеличение количества NK-клеток в периферической крови встречается при вирусных заболеваниях, повышается при злокачественных новообразованиях и лейкозах, в периоде реконвалесценции, в некоторых случаях увеличение фиксируется при бронхиальной астме, может быть связано с активацией иммунитета после трансплантаций. Снижение данного показателя наблюдается при различных врожденных иммунодефицитах, паразитарных инфекциях, аутоиммунных заболеваниях, облучении, лечении цитостатиками и кортикостероидами, стрессе, дефиците цинка.

Необходимо отметить, что NK-лимфоциты представляют собой гетерогенную популяцию клеток, и уже при иммунофенотипирование общей фракции NK-клеток по маркерам CD16 и CD56 можно выделить их основных субпопуляций (рис. 92).

CD16 является низкоаффинным рецептором иммуноглобулинов G III типа (FcγRIII), с помощью которого осуществляется механизм клеточной цитотоксичности. Маркер CD56 (NCAM, Leu-19, NKH-1) является гликопротеином, принадлежащим к суперсемейству иммуноглобулинов, и принимает участие в реализации межклеточных контактов. При этом NK-клетки, активно экспрессирующие CD16 и CD56, определяются как зрелые. NK-клетки с фенотипом CD16–CD56+ проявляют цитотоксическую активность. NK-клетки с фенотипом CD16+CD56– в ответ на стимуляцию IL-2 начинают секретировать широкий спектр цитокинов, но проявляют слабую цитолитическую активность (цитокинпродуцирующие клетки).

Важным является определение на этих клетках различных маркеров активации характеризующие их функциональную активность и/или недостаточность. Среди них важнейшим является выделение субпопуляции цитолитических NK-клеток (обладают цитолитической активностью, но секретируют относительно немного цитокинов) и цитокин-продуцирующих натуральных киллеров (выделяют IFN-γ для активации других клеток, но обладают меньшей цитолитической активностью) и NKT-клетки обладающие большей цитотоксичностью. Экспрессия различных рецепторов позволяет судить о той или иной функции NK-лимфоцитов (табл.51).

Основные популяции NK-клеток

В норме увеличение той или иной субпопуляции клеток свидетельствует о наличии острого воспалительного процесса. При разрешении процесса происходит постепенно снижение показателя до нормального значения. Если количество активированных клеток находится на стабильно повышенном уровне, это может быть признаком хронического воспалительного процесса.

Оценка абсолютного и относительного содержания CD3+ Т-лимфоцитов и их субпопуляций в периферической крови осуществляется в диагностике широкого спектра патологических состояний. (рис.92).

К числу которых, в первую очередь, относятся первичные и вторичные иммунодефициты. Патологии связанные с нарушением дифференцировки и созревании Т-клеток (прежде всего лейкозы). Большое значение принадлежит оценки количества Т-лимфоцитов при острых и хронических вирусных инфекциях, включая ВИЧ-инфекцию и хронические вирусные гепатиты. Более того, определение уровня Т-лимфоцитов в периферической крови показало свою значимость при анализе образцов, полученных от пациентов с различными внутриклеточными инфекционными заболеваниями (например, при и нфицировании M.tuberculosis, M.lepra или Leishmania spp.), при септических состояниях, диагностике отторжения пересаженного трансплантата, реакции «трансплантат-против-хозяина» и при другой патологии (табл.50).

Традиционно, абсолютного числа Т-лимфоцитов в периферической крови трактуется как свидетельство «гиперактивности» иммунной системы пациента, которое может быть тесно  связано с различными Т-клеточными лимфомами или лейкозами. Тогда как увеличение относительного содержания этих клеток имеет место при некоторых вирусных и бактериальных инфекциях в дебюте заболевания, а также при обострениях хронических заболеваний. Снижение абсолютного количества Т-лимфоцитов может рассматриваться как «недостаточность» реакций специфического клеточного иммунитета и обнаруживается при воспалительных процессах разнообразной этиологии, злокачественных новообразованиях, после травмы, операций, инфаркта, приеме цитостатиков. Повышение их числа в динамике заболевания или на фоне проведения соответствующей терапии принято рассматривать в качестве клинически благоприятного признака.

Важным и одним из основных методов исследования Т-лимфоцитов является диагностика при исследовании первичных иммунодефицитов. При ТКИД, синдром Ди-Джорджи, синдром «голых лимфоцитов», Х-сцепленный лимфопролиферативный синдром, синдром Вискотта-Олдрича происходит значительное снижение Т-лимфоцитов.

Наличие большого числа T-клеток сопряжено с развитием аутоиммунных заболеваний.

Популяции Т-лимфоцитов состоит из различных субпопуляций. С клинической точки зрения важным является выделение эффекторных (цитотоксические и Тγδ- лимфоциты) и регуляторных (Т-хелперы и Тreg) клетки.

Цитотоксические Т-лимфоциты основные клетки адаптивного иммунитета (рис.53). Определение уровня Т-цитотоксических лимфоцитов с фенотипом CD3+CD8+ в периферической крови показало свою клиническую значимость при выявлении первичных иммунодефицитных состояниях, диагностике пациентов с различными вирусными инфекциями, при опухолевом росте и метастазировании, а также имеет важнейшее значение при исследовании специфической иммунологической памяти (оценка эффективности вакцинации). Так, повышение выявляется практически при всех хронических инфекциях, вирусных, бактериальных, протозойных инфекциях. Является характерным для начале ВИЧ-инфекции. Снижение же уровня CD3+CD8+ клеток в периферической крови может свидетельствовать о вирусных гепатитах, хронической герпес-вирусной инфекции, некоторых типах аутоиммунных заболеваниях.

Увеличение CD3+CD8+ обычно связано с ВИЧ-инфекцией, острыми вирусными инфекциями, парапротеинемиями, малярией, при дебют аутоиммунных заболеваний, множественной миеломе, хроническом вирусном гепатите, сепсисе, перитоните, гемофилии, шистосомозе, инфекционном мононуклеоз, абсцесс легкого, почки. Уменьшение при первичные иммунодефицитах (ТКИД, синдром Ди-Джорджи, синдром «голых лимфоцитов», Х-сцепленный лимфопролиферативный синдром, синдром Вискотта-Олдрича) вирусных инфекциях (герпес-вирусные инфекци (ВГ 1-2, 3 тип, ЦМВ, ВЭБ-инфекции), облучении, отравление диоксинами.

Для Т-хелперов, находящихся на терминальных стадиях дифференцировки, также характерно появление CD8 (обычно αα гомодимера) на поверхностной мембране. CD8 может обнаруживаться на поверхности Т-клеток, несущих γδ-Т-клеточный рецептор, а также на «инвариантных» НКТ-клетках. Способностью к экспрессии ααCD8 обладают некоторые популяции НК-клеток.

Важное значение принадлежит в определении стадии дифференцировки цитотоксических Т-лимфоцитов и определении на их поверхности активационных маркеров. В стадии дифференцировки CTL можно выделит: наивные CTL (Naïve), CTL центральной памяти (CM), CTL эффекторной памяти (EM) и терминально дифференцированные клетки памяти CTL (TEMRA) (рис.93)

Определение клеток с этими маркерами позволяют определить нарушение дифференцировки и могут быть единственным подтверждением причины развития того или иного патологического процесса.

Итоговые основные популяции ЦТЛ их активационных маркеров и нормативные показатели представлены в таблице (табл.54).

Основные популяции цитотоксических Т-лимфоцитов (% от CD3+CD8+ клеток)

По наличию тех или иных маркеров можно охарактеризовать функциональную активность клеток. Так CD3+CD4-CD8+CD25 CTL клетки с ранним маркером активации, CD3+CD4-CD8+CD38 – с метаболическим маркером активации, CD3+CD4-CD8+CD11b и CD3+CD4-CD8+CD62L – активно мигрирующие CTL, CD3+CD4-CD8+CD297(PD1) — конечно дифференцированные CTL. В недалёком бедующем появятся нормативные показатели и для этих субпопуляций клеток, но уже в настоящее время при отсутствии данных параметров можно топически определить причину развития той или иной иммунопатологии.

Тγδ- лимфоциты. Так же, как и CTL осуществляют эффекторную функцию напрямую используя рецепторный аппарат так и с использованием АТ. Они выделяют большое количество провоспалительных цитокинов. Некоторые клетки выполняют функции АПК.

В отличии от основной Т-клеточной популяции экспрессирующей αβ CD3 рецепторов на них представлен γδ-рецептор. Отличительной чертой этих клеток является отсутствие на поверхности CD4 и CD8, что позволяет предварительно оценить количество Тγδ- лимфоцитов в крови. Помимо лейкоцитарного маркера CD45, как функциональные маркеры Тγδ- лимфоциты имеют рецепторы CD16 (к Fc-фрагменту антител), CD92L (запускает апоптоз клетки мишени), CD282 (TLR2), CD204 (скавенджер-рецепторы). На части клеток помимо MHC I продуцируются и МНС II класса.

Увеличение циркуляции субпопуляции Тγδ-клеток позволяет предположить наличие стимуляции иммунной системы, особенно на слизистых оболочках и коже. В острую фазу воспаления их количество в периферической крови может увеличится в разы. При медленно прогрессирующих инфекционных заболеваниях увеличение Тγδ- лимфоцитов может служить дополнительным критерием активности процесса.

В настоящее время нормативных показателей для этих субпопуляций клеток нет, но по количеству клеток с той или иной функцией можно охарактеризовать функциональную активность Тγδ- лимфоцитов, определить роль этих клеток например в процессах антигенпрезентации, эффекторных функций и/или процессах регенерации.

 В-лимфоциты. Выявление В-лимфоцитов производится на основании экспрессии CD19. CD19 является важнейшим компонентом рецепторного аппарата В-клеток, без которого функционирование данной популяции лимфоцитов невозможно (рис.94). Экспрессия CD19 обнаруживается со стадии про-В-клетки и сохраняется на протяжении всей жизни В-лимфоцита, несколько снижаясь лишь на плазматических клетках. Более того, этот антиген рассматривается в качестве «линейного» маркера всех В-лимфоцитов. Его экспрессия может быть обнаружена в некотором количестве на фолликулярных дендритных клетках, относительное содержание которых в периферической крови крайне низко.

Что касается плотности экспрессии CD19, то один В-лимфоцит несет на своей поверхности около 18 тысяч молекул. Поэтому для анализа экспрессии CD19 рекомендуется применять антитела, конъюгированные с яркими флуорохромами.
В-лимфоциты играют ведущую роль в формировании эффективно функционирующего специфического гуморального иммунитета, благодаря своей способности дифференцироваться в антитело-синтезирующие плазматические клетки и формированию долгоживущих клеток иммунологической памяти. Поэтому клиническая значимость определения уровня СD19+ лимфоцитов в циркулирующей крови показано при широком круге патологических состояний, связанных с нарушением синтеза антител (табл.55)

В первую очередь, определение В-клеток важно при диагностике первичных иммунодефицитов, связанных с наличием агаммаглобулинемии и дисгаммаглобулинемии. Данный показатель необходим при скрининге и выявлении системных аутоиммунных патологических состояний, связанных с наличием высокого титра аутореактивных антител в сыворотке крови (системная красная волчанка, ревматоидный артрит, синдром Шегрена и т.д.). Кроме того, анализ содержания

В-лимфоцитов в перфиерической крови значим при инфекционных бактериальных заболеваниях и паразитарных инвазиях; злокачественных новообразования, связанных с неконтролируемым делением клонов В-лимфоцитов (лимфолейкозы, лимфомы, миеломная болезнь и т.д.). Так, снижение уровня этих клеток в циркуляции наблюдается при физиологических и врожденных иммунодефицитах, острой вирусной и хронической

бактериальной инфекциях. Увеличение доли этих клеток в рамках лимфоцитарного пула отмечается при некоторых аутоиммунных заболеваниях, хронических заболеваниях печени, муковисцедозах, бронхиальной астме, паразитарных и грибковых инфекциях.
Важными показателями являются стадия дифференцировки и активационные маркеры В-лимфоцитов, а также идентификация в периферической крови В1-клеток (табл.56).

Основные субпопуляции В-клеток (% от В-клеток)

Окраска антителами против IgD и CD38 позволяет идентифицировать следующие популяции В-клеток: “наивные” Bm1 клетки с фенотипом IgD+CD38-, “активированные наивные” Bm2 клетки (IgD+CD38+), Bm2’ – клетки-предшественники В-клеток герминального центра (IgD+CD38++), общая субпопуляция, включающая в себя центробласты и центроциты – так называемые “Bm3+Bm4” клетки (IgD-CD38++), клетки ранней памяти eBm5 (IgD-CD38+) и покоящиеся клетки памяти Bm5 (IgD-CD38-). Окраска антителами против поверхностных молекул IgD и CD27 позволяет отделить группу «наивных» клеток с фенотипом IgD+CD27- от трех разновидностей клеток памяти – клетки памяти с непереключенным классом синтезируемых антител (“unswitched” IgD+CD27+), клетки памяти с переключенным классом синтезируемых антител (“class-switched” memory cells, IgD-CD27+) и так называемые «дважды-негативные» клетки памяти (IgD–CD27–).

Антиген презентующие клетки. Функция АПК клеток описана нами выше (см. главы 3 и 4). В периферической крови их достаточно мало и основным представителем здесь являются моноциты (рис.95).

Среди моноцитов (линейным маркером которых долгое время считался CD14) по экспрессии CD16 можно выявить ряд популяций. Популяция «классических» моноцитов CD16 не несет (на них обнаруживается только CD14, их фенотип описывается как CD14⁺⁺CD16^–), в то время как моноциты «неклассической» и «переходной» популяций CD16 экспрессируют (фенотипы CD14⁺CD16⁺⁺ и CD14⁺⁺CD16⁺, соответственно). Основная функция классических моноцитов, как и макрофагов, фагоцитоз апоптотических телец. За счет низкой экспрессией HLA-DR, они слабо выполняют функцию антигенпрезентации.

Наоборот, неклассические моноциты слабо фагоцитируют апоптотические клеток, но за счет экспрессии большого количества HLA-DR и костимуляторных молекул они активно выполняют функцию антигенпрезентации и продукции провоспалительных цитокинов.

Переходные моноциты образуются в результате активации и дифференцировки классических моноцитов. Их основные функции: распознавание PAMP и синтез цитокинов (как провоспалительных -TNFα, IL-1β, так и противовоспалительных IL-10), IgG-опосредованный фагоцитоз, антигенпрезентация.

Одним из важнейших клинических критериев в диагностике прежде всего критических состояний принадлежит определению HLA-DR на моноцитах. Значительное снижение экспрессии HLA-DR может служить тестом для идентификации временной иммунодепрессии и коррелирует с неблагоприятным исходом при сепсисе, травме, панкреатите, при осложнениях в сердечно-легочной хирургии, после трансплантации у пациентов после удаления опухоли. Резкое снижение HLA-DR на моноцитах может служить показателем для применения более раннего терапевтического вмешательства с использованием IFNγ, растворов обогащенных глютамином и мурамилсодержащие гликопептиды, чтобы стимулировать иммунную систему и в первую очередь антигенпрезентирующую функцию моноцитов.

Нормативные показатели моноцитов представлены в таблице (табл.57). В настоящее время используя проточную цитометрию возможно оценить и другие функции моноцитов такие как миграционная активность (CD11b+, CD62L+), метаболические свойства (CD38+, CD184+), костимуляторные возможности ( CD80+, CD86+), однако нормативные показатели и их клиническая интерпретация пока не описаны.

Основные показатели моноцитов (% от моноцитов)

Регуляторные клетки. Большая популяция клеток врожденного и адаптивного иммунитета. Некоторые клетки (цитокинпродуцирующие NK-клетки, миелоидные супрессорные клетки) описаны нами выше. Некоторые клетки в практике идентифицировать практически невозможно. Основной популяцией регулирующие большинство этапов иммунного ответа являются Т-хелперы и Т-регуляторные лимфоциты.

Т-хелперы. CD4 представлен на поверхности отдельной субпопуляции Т-лимфоцитов, получивших название Т-хелперов и обладающих фенотипом CD3+CD4+, то есть клетки, экспрессирующие эти две молекулы одновременно. В ходе развития Т-лимфоцитов CD4 обнаруживается в тимусе, начиная со стадии DP, после чего сохраняется на Т-хелперах до терминальных стадий дифференцировки. CD4 обнаружен на мембране моноцитов, макрофагов и некоторых популяций дендритных клеток.

Именно поэтому для корректного выделения Т-хелперных клеток в рамках проведения иммунофенотипирования необходимо оценивать ко-экспрессию CD3 и CD4, чтобы избежать контаминации данной популяции Т-лимфоцитов другими клетками периферической крови. Клинические нормативы числа Т-хелперов представлены в таблице (табл.58).

Определение содержания CD4+ Т-клеток отводится решающая роль при прогнозе течения ВИЧ-инфекции и эффективности проведения антиретровирусной терапии. Кроме того, изменения уровня Т-хелперов значимо при выявлении врожденных и приобретенных иммунодефицитных состояниях, связанных с нарушениями реакций клеточного иммунитета и дефектами продукции антител при специфическом гуморальном ответе, опосредованном В-лимфоцитами.

Так, увеличение абсолютного и относительного содержания CD3+CD4+ периферической крови тесно связано с наличием аутоиммунных заболеваний, может быть иметь место при некоторых типах аллергических реакциях и инфекционных процессах. Тогда как снижение абсолютного и относительного уровня Т-хелперов в циркуляции указывает на «гипореактивный» синдром с нарушением регуляторного звена иммунитета, а также встречается при различных хронических заболеваниях (бронхитах, пневмониях и т.д.), опухолевом росте (в первую очередь, при солидных опухолях различной локализации).

По наличию на Т-хелперов различных хемокинов рецепторов можно определить их субпопуляцию (табл. 59).

Основные популяции Т-хелперов (% от CD3+CD4+ клеток)

Большое значение принадлежит определению стадии дифференцировки Т-хелперов (табл.60).

Основные показатели Т-хелперов

Не потеряло свое значение анализ соотношения CD4/CD8. Соотношение субпопуляций Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток (также известное под устаревшим названием «иммунорегуляторный» индекс) является расчетным показателем, получаемым в результате деления величины относительного (или абсолютного) содержания CD3+CD4+ клеток на аналогичное значение CD3+CD8+ клеток (рис.96).

В норме это значение находится в пределах 1,5–2,6, тогда как при ряде патологических состояний, связанных с нарушениями в функционировании клеточных механизмов приобретенного иммунитета, эта величина существенно изменяется. Классическим примером является сниженное соотношение CD4/CD8 при ВИЧ-инфекции (см. рис.79. На гистограммах приведены результаты анализа распределения клеток по экспрессии CD4 (ось абсцисс) и CD8 (ось ординат) в рамках популяции Т-лимфоцитов. У условно здорового донора CD4/CD8 составляет 2,09 (62,17/29,68=2,09), тогда как у пациента с ВИЧ инфекцией – 0,55 (31,87/58,29=0,55). В целом, устойчиво низкое соотношение CD4/CD8 в течение длительного применения антиретровирусной терапии является маркером нарушений в функционировании иммунной системы, наличия хронического воспалительного процесса, а также высокого риска заболеваемости «сопутствующими» инфекциями, и, как следствие, повышенной вероятности летального исхода.

Однако, снижение соотношения CD4/CD8 наблюдается и при врожденных иммунодефицитах (синдром Ди-Джоржи, Незелофа, Вискотта-Олдрича), при других вирусных и бактериальных инфекциях, хронических процессах, воздействии радиации и токсических химических веществ, множественной миеломе, стрессе, снижается с возрастом, при эндокринных заболеваниях, солидных опухолях. Увеличение соотношения CD4/CD8 более 3 – отмечается при широком круге аутоиммунных заболеваний, остром Т-лимфобластном лейкозе, тимоме, хроническом Т-клеточном лейкозе.

Т-регуляторные лимфоциты (Treg) это отдельная популяция Т-хелперов. Интерес к популяции этих клеток как основной популяции клеток, способной подавлять развитие иммунного ответа не обошел вниманием клиницистов. В настоящее время используя тактику «гейтирования», основанная на оценке CD25 и CD 127, возможно эффективно выделять Treg в периферической крови взрослых пациентов, пуповинной крови, а также клетках, выделенных из лимфатических узлов и тимуса, опухолевой ткани (рис.97).

Увеличение содержания Treg определяется у больных с различными видами опухолей и связан с прогрессированием опухолевого роста. Более того, уровень этих клеток в циркуляции и в окружающих опухоль тканях оказался значимым для прогноза течения заболевания и эффективности применяемой терапии. Существенную роль Treg играют в подавлении иммунного ответа при инфекциях. При вирусном гепатите С, туберкулезе, паразитарных инвазиях число Treg значительно повышается. При сепсисе увеличение уровня этих клеток напрямую связано с неблагоприятным течением данного заболевания. С другой стороны, у
Рис. 97. Идентификация Т-регуляторных клеток
Анализ образов периферической крови проведен на проточном цитометре Navios 3/10 (Beckman Coulter Inc., USA), полученные результаты обработаны при помощи Kaluza Softvare 2.1 (Beckman Coulter Inc., USA).
больных с различными аутоиммунными патологическими состояниями изменялась функциональная активность Treg, что вызывало нарушение толерантности к собственным антигенам организма.

Однако подобные закономерности не всегда выполняются, что указывает на то, что в развитии патологических процессов Treg имеют важное, но не единственное значение. Этим и обусловлена важность проведения топической диагностики. В этой связи интересно определение других показателей Т-регуляторных клеток (табл.61).

Основные показатели Т-регуляторных клеток

Основными регуляторными молекулами иммунной системы являются цитокины. Как мы отмечали выше у здоровых людей концентрация цитокинов в периферической крови ничтожно мала и обычно не определяются т.к. их выработка и действие осуществляется местно, локально. Однако при развитии патологического процесса при несостоятельности местных защитных реакций синтез прежде всего провоспалительных цитокинов возрастает в разы, что может служить эффективным биомаркером (табл.62).

Нормативные значение цитокинов в клинических ситуациях

Особенно важно их определять для диагностики вторичного гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза (синдром активации макрофагов (MAS) синдрома системного воспалительного ответа (SIRS), и синдрома полиорганной дисфункции (MODS) они имеют общие клинические и лабораторные проявления (лихорадка; цитопения двух линий клеток; гипертриглицеридемия и/или гипофибриногенемия; гиперферритинемия (> 500 мкг/л), гемофагоцитоз; повышенный уровень растворимости рецептор интерлейкина-2 (CD25); снижение активности NK-клеток; спленомегалия;  повышение АСТ (>48 Ед/л)), когда повышение определенного цитокина служит основанием для проведения таргетной терапии.

Хотелось бы обратить внимание на то, что не следует путать проявления иммунных нарушений и их классификацию с различной иммунопатологией определенной в том числе и в МКБ-10 (или уже МКБ-11). Так же как печеночная или сердечная недостаточность и, например хронический гепатит или инфаркт миокарда. Иммунопатологию можно определить как болезни иммунной системы, индуцированные состояния под воздействием факторов, влияющих на иммунную систему, и отдельная категория аутоиммунных и аллергических болезней с избыточным или извращенным реагированием иммунной системы. Они на сегодняшний день представляет группы заболеваний схожие клинически, но с различными иммунопатологическими механизмами (рис.98).

Не исключается, что в основе многих, а может быть практически и всех клинических формах иммунных нарушений, лежит первичная иммунологическая недостаточность какого-то компонента иммунной системы, скомпенсированная до определенного времени за счет нормальной или высокой функциональной активности других компонентов этой системы. Подтверждением такой возможности служит общая вариабельная иммунная недостаточность (ОВИН), чаще всего проявляющаяся в хронических, рецидивирующих инфекциях бронхолегочного аппарата и придаточных пазух носа. Для этого заболевания характерно понижение уровня всех классов иммуноглобулинов. При ОВИН имеется два пика заболеваемости: первый развивается между 6–10 годами жизни, второй – между 26–30 годами, причем до развития заболевания эти больные являются практически здоровыми людьми. Следовательно, этот дефект до определенного времени был компенсирован за счет нормальной или повышенной функциональной активности других компонентов иммунной системы, обеспечивающих защиту организма от инфекции. Помимо ОВИН есть ряд болезней, относящихся к первичным иммунодефицитам, но иногда проявляющихся клинически у взрослых (см. ниже глава 12). Как правило, в этих случаях отсроченное наступление симптомов заболевания является результатом наличия у данного индивидуума умеренного генетического дефекта. Но нельзя исключить и компенсаторной коррекции первичного дефекта за счет других компонентов иммунитета. Их изменение со временем и позволяет клинически проявиться первичному, пусть даже легкому дефекту иммунной системы. Поэтому если на настоящем этапе не выявлены причины иммунопатологии, то это не только следствие неадекватного методического подхода, использования несоответствующего материала для исследования, но и невозможность идентифицировать имеющуюся поломку на данном этапе развития науки.