Клеточно-тканевая терапия – профилактика или лечение болезней человека путем введения живых клеток и/или ткани, которые были отобраны, размножены и обработаны или изменены вне организма. Цель такой терапии – заместить, восстановить или улучшить функцию поврежденной ткани или органа.

В настоящее время в медицине необходимо выделить несколько направлений по развитию клеточно-тканевой терапии (рис. 131).

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток.

Первыми трансплантировать клетки человеку, не осознавая этого, уже давно начали трансфузиологи. При переливании крови в организм реципиента попадает небольшое количество содержащихся в крови донора стволовых клеток (СК). Недавно было показано, что эти клетки внедряются в ткани реципиента и дифференцируются. Как кровь, так и костный мозг содержат СК, дающие начало всем клеткам крови. Из донорских СК образуются нормальные, не пораженные раком лейкоциты и лимфоциты, что улучшает состояние пациента. Но наиболее эффективным является трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ранее называющееся пересадкой костного мозга).

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток – это медицинская технология, при которой производится перенос здоровых мультипотентных кроветворных стволовых клеток, полученных из костного мозга, периферической крови или пуповинной крови донора реципиенту. Донор и реципиент могут быть одним и тем же человеком (аутологичный трансплантат) или двумя разными людьми (аллогенный трансплантат).

Аутологичной трансплантации необходима при высокодозной химиотерапии и/или облучении приводящей к повреждению кроветворной системы. Тогда здоровые стволовые клетки забираются у пациента до начала лечения, и возвращаются ему после миелоаблативной (уничтожающей костный мозг) терапии.

Трансплантация аллогенных стволовых клеток используется при различных формах заболеваний, когда необходимо «заменить» костный мозг при опухолях иммунной системы (острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, лимфома Ходжкина и неходжкинская лимфома (рецидивирующая, рефрактерная), нейробластома, саркома Юинга, множественная миелома, миелодиспластические синдромы, глиомы и другие солидные опухоли) или у пациента существует врожденный дефект (талассемия, серповидноклеточная анемия, апластическая анемия, анемия Фанкони, злокачественный детский остеопетроз, мукополисахаридоз, дефицит пируваткиназы). Особую группу составляют первичные иммунодефициты (ТКИН, синдромами Вискотта-Олдрича, Оменна, Ниймигена, хроническая гранулематозная болезнь, гипер IgM синдром).

В процессе выполнения трансплантации гемопоэтических стволовых клеток выделяют несколько этапов.

Подбор донора.

Оценка и тестирование донора — очень важные вопросы, влияющие на качество и безопасность донорства. Потенциальным донором стволовых гемопоэтических клеток может стать любой дееспособный человек в возрасте от 18 до 55 лет с отсутствием определенных заболеваний (табл.121).

Условия для доноров стволовых гемопоэтических клеток

Для того, чтобы стать потенциальным донором костного мозга (быть зачисленным в регистр), необходимо пройти HLA-типирование. Данные регистрируются и входят в единую базу Всемирной ассоциации доноров костного мозга (https://wmda.info).

В поисках донора обычно обращается к разным родственникам пациента (братьям и сестрам), чтобы найти одинаковые маркеры HLA. Однояйцевые близнецы часто наиболее совместимы друг с другом. При отсутствии совпадений выполняется поиск в базе Всемирной ассоциации доноров костного мозга, в котором сейчас зарегистрировано более 38 миллионов добровольцев с информацией HLA

В дальнейшем при совместимости с определенным пациентом решается вопрос о методах забора костного мозга или периферических стволовых кроветворных клеток

Забор и хранение гемопоэтических стволовых клеток.

В настоящее время существует два метода сбора стволовых клеток: классический сбор костного мозга и теперь более распространенное донорство стволовых клеток периферической крови. Кроме того, существует возможность с некоторыми ограничениями получения стволовых клеток из пуповинной крови.

Классический метод трансплантации стволовых клеток — это перенос красного костного мозга. Как правило, с помощью специальной иглы у донора из гребня подвздошной кости берут около 1 литра смеси костного мозга и крови. Из них выделяют стволовые клетки, при необходимости, очищают и затем переливают реципиенту.

Более щадящий метод является цитаферез. Этот в настоящее время наиболее распространенный способ забора стволовых клеток. За несколько дней до донорства костный мозг стимулируется подкожной инъекцией G-CSF, которые вызывают выход гемопоэтических стволовых клеток из костного мозга в кровь. В последующим используя аферез периферические стволовые клетки собираю. Забор осуществляют один — два раза в течение 3-4 часов.

В связи с высокой концентрацию гемопоэтических стволовых клеток в плаценте и пуповине перспективным является сбор пуповинной крови. Небольшого количество крови, полученное из пуповины (обычно около 50 мл), осложняет ее применение для взрослых. Требуется «наращивание клеток» и/или использовать несколько единиц пуповинной крови от разных доноров.

В отличие от других органов, клетки костного мозга можно замораживать (криоконсервировать) в течение длительных периодов времени, не повреждая слишком много клеток. Это необходимо для аутологичных трансплантаций. В случае аллогенных трансплантатов свежие клетки предпочтительней тем не менее допускается их хранение до 72 часов при температуре +4-8 градусов. Учитывая, что пуповинную кровь можно получить только во время родов, для ее хранения используются специальные банки пуповинной крови.

Проведение трансплантации.

Когда донор найден и подтверждена его совместимость, пациент подвергается кондиционированию. Цель этой процедуры уничтожение собственного костного мозга, подавление иммунитета с целью снизить риск отторжения донорских клеток. Проводят полную или неполную миелоаблацию. Для этого он получит химиотерапию с облучением, в течение десяти дней. Пациент находится в стерильной комнате (чистые помещения), потому что кондиционирование вызовет глубокую аплазию пациента, разрушив его иммунную систему. Велик риск развития инфекций.

Фактическая трансплантация проводится в виде инфузии, через которую приготовленный костный мозг получает пациент. Трансплантированные клетки будут размещаться в костях, постепенно восстанавливая всю ткань костного мозга и возобновляя производство различных клеток крови. Это происходит через 10–30 дней после трансплантации, в течение которых необходимо продолжать защищать пациента от инфекционных агентов. По истечении 3 месяцев иммунная система может быть восстановлена. Однако возможны осложнения в виде развития инфекций, веноокклюзионной болезни, мукозите, геморрагическом цистите.

Самое частое и опасное осложнение — реакция трансплантат против хозяина (РТПХ). Это атака «новых» иммунных клеток костного мозга на ткани реципиента. Острая РТПХ обычно возникает в первые 3 месяца после трансплантации и может поражать кожу , кишечник или печень. Для лечения РТПХ применяются препараты, угнетающие иммунитет (иммуносупрессоры),

Прогноз при трансплантации костного мозга широко варьируется в зависимости от типа заболевания, стадии, источника стволовых клеток, HLA-совместимого статуса и режима кондиционирования. Однако трансплантация дает шанс на выздоровление или долгосрочную ремиссию. В последние годы показатели выживаемости постепенно улучшаются.

Клеточная регенеративная терапия

Этот раздел медицины занимается лечением различных заболеваний путем восстановления пораженных органов и тканей с помощью трансплантации клеток (клеточная терапии) и/или путем стимуляции эндогенных стволовых клеток.

Фундаментальные основы развития данного направления положили наши отечественные ученые А.А. Максимов и  А.Я. Фриденштейн (рис.132).

Рис. 132. Ученые, создавшие основу регенеративной медицины

В настоящее время к клеточным технологиям относят всю совокупность методов и практик всех этапов работы с клетками: технологии получения исходного биоматериала, всей работы in vitro и собственно клеточной терапии: заместительной и восстановительной, прямой и непрямой. Стволовые клетки являются самым важным объектом исследований и ключевым субстратом клеточных технологий – и клеточной терапии в первую очередь. Однако существует и другие подходы лечения разных заболеваний, основанных на применении иных типов клеток, не являющихся стволовыми. Описано применение клеточной терапии для регенерации практически всех типов тканей. В зависимости от типа ткани и патологии значительно отличаются уровни разработки клеточных продуктов. Это связано, с одной стороны, с методологическими особенностями производства и применения клеточных продуктов, с другой — с особенностями дифференцировки типов клеток, использующихся в регенеративной медицине, прежде всего мезенхимальных стволовых клеток (МСК).

Регенерация кожных покровов

Показаны хорошие результаты с применением аутологичного донорского материала. Аллогенные кожные трансплантаты в подавляющем большинстве случаев вызывают реакцию отторжения. В качестве альтернативы исследователи предлагают комбинированные продукты, состоящие из биоразлагаемой матрицы (как правило, на основе коллагена или фибрина) в сочетании с прогениторными и дифференцированными клетками (МСК, кератиноциты, фибробласты). Данный тип тканеинженерных продуктов используют при терапии ожогов, диабетической стопы, перианальных свищей, а также для послеоперационного восстановления стенок полых органов — пищевода, мочевого пузыря, некоторых отделов кишечника и трахеи. За рубежом уже зарегистрированы тканеинженерные продукты для регенерации кожи и слизистых на основе аллогенных фибробластов и кератиноцитов: Apligraf, Gintuit (США); Holoderm®, Keraheal, Cure-skin, Kaloderm, KeraHeal-Allo (Южная Корея); JACE (Япония). В ЕС и Южной Корее зарегистрированы клеточные продукты Alofisel и Cupistem для лечения пери анальных свищей при болезни Крона, представляющие собой аллогенные МСК, выделенные из жировой ткани взрослых доноров.

Регенерация суставов и костей

Регенерация костей и суставов на основе жизнеспособных клеток человека наиболее используемая и изучаемая область применения в клинической практике методов лечения. Существует значительное количество зарегистрированных клеточных продуктов, предназначенных для регенерации хрящевой ткани на основе аутологичных хондроцитов, суммарный опыт применения которых насчитывает уже более десяти лет: MACI (США); ChondroCelect, Spherox (ЕС); JACC (Япония); Chondron, Cartistem (Южная Корея); Cartogen (Австралия, Сингапур).

Восстановление костной ткани сопряжено с рядом трудностей. Несмотря на возможность полной замены кости металлическим или композитным имплантом, невозможно достигнуть полного восстановления ее опорно-двигательной функции вследствие неполной регенерации сопутствующего двигательного аппарата (связок, сухожилий). Введение МСК в трансплантат позволяет обеспечить лучшее сродство тканей организма с реконструированным участком за счет дифференцировки используемых клеток в остеобласты и затем в остеоциты. Разработки клеточных продуктов, используемых для регенерации кости, реализованы в рамках значительного количества пилотных исследований. Однако в настоящее время зарегистрирован всего лишь один продукт — RMS Ossron (Южная Корея), состоящий из аутологичных остеобластов.

Регенерация нервной ткани

Способности нервной ткани взрослого человека к регенерации сильно ограничены, в связи с этим практически отсутствуют способы лечения нарушений, связанных с повреждениями органов нервной системы, обладающие доказанной эффективностью. Несмотря на значительное число исследований, посвященных применению клеточной терапии для регенерации нервной ткани, большинство из них проводилось на очень ограниченном числе пациентов, что связано преж де всего с трудностью доставки клеток к местам ее повреждения.

Регенерация сердечной мышцы

Сердечная поперечнополосатая мышечная ткань имеет ограниченную способность к регенерации, поэтому полное восстановление миокарда после инфаркта практически никогда не происходит. Тем не менее считается, что под воздействием клеточной терапии происходит дифференцировка мультипотентных клеток в кардиомиоциты; ингибируется фиброз миокарда; экспрессия ангиогенных, антиапоптотических факторов и цитокинов, стимулирующих пролиферацию кардиомиоцитов. В настоящее время зарегистрированы следующие клеточные продукты, предназначенные для регенерации тканей сердца: из аутологичные миобластов скелетных мышц — HeartSheet (Япония), и аутологичные МСК — Hearticellfram-AMI (Южная Корея).

Регенерация печени

Исследования по изучению безопасности, переносимости и клинической эффективности трансплантации аутологичных костномозговых мононуклеарных клеток и мезенхимальных стромальных клеток в комплексном лечении пациентов с хроническими гепатитами и циррозом печени показало безопасность и эффективность метода. Данный подход можно рассматривать как один из методов, предупреждающих дальнейшую прогрессию заболевания, а в случае декомпенсированных форм ЦП – как временное пособие, позволяющее дождаться трансплантации печени.

Генная терапия

Под генной терапией подразумевается совокупность молекулярно-генетических и медицинских методов, направленных на внесение изменений в генетический аппарат клеток человека в целях лечения заболеваний.

Новые высокоэффективные и простые в использовании инструменты редактирования генома открывают возможность лечения наследственных, онкологических и инфекционных. заболеваний.

Концепция генной терапии заключается в устранении генетической проблемы в ее источнике. Если, например, при наследственном заболевании (обычно рецессивном) мутация в определенном гене приводит к выработке дисфункционального белка, можно использовать генную терапию для доставки копии этого гена, не содержащей вредной мутации, и тем самым производит функциональный белок. Эта стратегия называется генной заместительной терапией.

В настоящее время наиболее распространёнными методами геномного редактирования являются нуклеазы цинковых пальцев (ZFNs), эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALENs), и система CRISPR/Cas9.

Нуклеазы цинковых пальцев (ZFNs) представляют собой класс сконструированных ДНК-связывающих белков, которые облегчают целевое редактирование генома, создавая двухцепочечные разрывы в ДНК в указанных пользователем местах. Двухцепочечные разрывы важны для сайт-специфического мутагенеза, поскольку они стимулируют естественные процессы репарации ДНК клетки, а именно гомологичную рекомбинацию и негомологичное соединение концов (NHEJ). Благодаря внедрению установленных, проверенных на практике методов, эти процессы могут быть использованы для создания точно направленных изменений генома, в результате чего получаются линии клеток с точными и наследуемыми делециями, интеграциями или модификациями генов.

Эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции (TALEN), представляют собой рестрикционные ферменты, которые могут быть сконструированы для разрезания определенных последовательностей ДНК. Их получают путем слияния эффекторного ДНК-связывающего домена TAL с доменом расщепления ДНК. Эффекторы, подобные активаторам транскрипции (TALE), могут быть сконструированы для связывания практически с любой желаемой последовательностью ДНК, поэтому в сочетании с нуклеазой ДНК можно разрезать в определенных местах. Рестрикционные ферменты могут быть введены в клетки для использования при редактировании генов или для редактирования генома in situ , метод, известный какредактирование генома с помощью инженерных нуклеаз .

Система CRISPR/Cas9 состоит из двух основных частей. Первой является белок, нуклеаза Cas9, которая способна вносить двуцепочечный разрыв в молекулу ДНК. Вторая представляет собой небольшую молекулу состоящие из прямых повторяющихся последовательностей, которые разделены уникальными последовательностями (спейсерами). Спейсеры заимствуются из чужеродных генетических элементов, с которыми сталкивалась клетка. В последующем распознавая эти спейсеры Cas9 разрезает ДНК. CRISPR/Cas9 можно использовать для редактирования ДНК в культуре клеток человека. Более того. выяснилось, что технология позволяет не только удалять ненужные гены, но и вставлять на их место другие. Для этого достаточно добавить ферменты, восстанавливающие ДНК.

Система доставки осуществляется путем загрузки генов в посредник, известный как вектор. Затем вектор «инфицирует» клетки-мишени, вводит ген в клетку и, таким образом, воспроизводит недостающий белок. В качества вектора могут выступать рекомбинантные вирусы и голая ДНК или комплексы ДНК.

К сожалению, в настоящее время в клинической практике эти методы лечения недоступны. Сегодня клинические исследования проводят для 6 наследственных заболеваний: мукополисахаридозов I и II типов, серповидно-клеточной анемии, β-талассемии, гемофилии В и врожденного амавроза Лебера 10.

Клеточная иммунотерапия

Использование живых клеток в качестве «лекарства» представляет собой отход от традиционного взгляда на «лекарство» как на небольшую молекулу или антитело, выполняющее единственную функцию. Клетки — это динамические живые агенты, которые в отличии от обычных лекарств могут интегрировать ряд входных сигналов, реагировать на изменения в окружающей среде, взаимодействовать с другими клетками и посредством сложных сигнальных путей вызывают спектр ответов. В дополнение к этому клеточные препараты могут сохраняться в организме от месяцев до лет, тогда как большинство обычных лекарств метаболизируются и выводятся из организма вскоре после приема, добавляя еще одну проблему к сложности взаимодействия между пациентом и лекарством.

Т-клеточная терапия.

Существует три основных типа терапии на основе Т-клеток: лимфоциты, инфильтрирующие опухоль (TIL), TCR-T-клетки и CAR-T-клетки. Последние две технологии состоят из генетически измененных Т-клеток, в которых опухолевая специфичность индуцируется ex vivo путем вставки рецептора химерного антигена (CAR) в случае CAR-T-клетки или, альтернативно, трансфекции TCR, специфичного к определенному опухолевому антигену, в T-клетку. клетка, создающая TCR-T-клетку. Напротив, TIL предпочтительно являются опухолеспецифичными до культивирования, поскольку они извлекаются из опухолевого материала и, как таковые, примированы in vivo увеличены и повторно введены пациенту.

Врожденные Т-клетки

Гамма-дельта (γδ) Т-клетки. Основой для применения этой группы клеток связано с тем, что они обладают чрезвычайно сильным противоопухолевым действием как in vitro, так и in vivo. Присутствие инфильтрирующих γδ Т-клеток было наиболее надежным предиктором положительных результатов при различных типах рака. Конструкции γδ TCR и γδ CAR-T-клеток находятся в настоящее время в эксперементе.

Природные киллерные Т-клетки (NKT). Существует несколько подходов для использования потенциала NKT-клеток для иммунотерапии рака которые показали свою эффективность, хотя терапия для клинического применения еще не одобрена.

Терапия на основе NK-клеток

В отличие от клеток адаптивной иммунной системы эффекторные клетки врожденного иммунитета, такие как NK-клетки, демонстрируют значительную цитотоксичность в отношении рака и инфицированных вирусом клеток без предварительной сенсибилизации

Клетки LAK

Это смесь NK-клеток, NKT-клеток (NKT) и CTL-клеток после инкубация с высокой дозой IL-2 способные более активно лизировать опухолевые клетки. Однако в клинической практике такой эффект не достигнут.

Клетки CIK

Добавление IFNγ и стимуляции анти-CD3 к высоким дозам IL-2 привело к культивированию более цитотоксического набора клеток, названных клетками-киллерами, индуцированными цитокинами (CIK). Достигнут успех при их применении в клинических испытаниях, особенно у пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой и глиобластомой. Однако клетки CIK еще не получили широкого распространения в клинической практике

CAR-NK клетки

Несколько групп показали эффективность использования клеток CAR-NK в качестве цитотоксических медиаторов против колоректального рака и клеточных линий острого миелоидного лейкоза в доклинических исследованиях in vitro. В настоящее время проводится несколько клинических испытаний, в которых набирают пациентов для оценки безопасности, осуществимости и эффективности CAR-NK при злокачественных новообразованиях. О результатах этих исследований на сегодняшний день не сообщается.

Терапия дендритными клетками. Метод вызывает противоопухолевые реакции, заставляя дендритные клетки представлять опухолевые антигены лимфоцитам, что активирует их, заставляя их убивать другие клетки, представляющие антиген. Дендритные клетки в иммунной системе представляют собой антигенпрезентирующие клетки (APC). При лечении рака они способствуют нацеливанию на раковый антиген.

Одним из методов индукции дендритных клеток для презентации опухолевых антигенов является вакцинация аутологичными опухолевыми лизатами или пептидами. Эти пептиды в сочетании с адъювантами для усиления иммунного и противоопухолевого ответа. Другие адъюванты включают белки или другие химические вещества, которые привлекают и/или активируют дендритные клетки, такие как GM-CSF. Наиболее распространенными источниками антигенов, используемых для дендритно-клеточной вакцины при глиобластоме (GBM) как агрессивной опухоли мозга, были лизат цельной опухоли, РНК антигена CMV и связанные с опухолью пептиды, такие как EGFRvIII.

Другая стратегия — выделить дендритные клетки из крови пациента и активировать их вне тела (рис.133). Дендритные клетки активируются в присутствии опухолевых антигенов, которые могут представлять собой один опухоль специфический пептид/белок или лизат опухолевых клеток. Эти клетки инфузируются и вызывают иммунный ответ.

Терапия дендритными клетками включает использование антител, которые связываются с рецепторами на поверхности дендритных клеток. К антителу могут быть добавлены антигены, которые могут вызывать созревание дендритных клеток и обеспечивать иммунитет к опухоли. Рецепторы дендритных клеток, такие как TLR3, TLR7, TLR8 или CD40 , использовались в качестве мишеней для антител. Интерфейс дендритных клеток и NK-клеток также играет важную роль в иммунотерапии. Разработка новых стратегий вакцинации на основе дендритных клеток также должна включать в себя способность стимулировать NK-клетки. Крайне важно систематически включать мониторинг NK-клеток в качестве результата клинических испытаний противоопухолевых ДК.