Учитывая многообразие клеток иммунной системы, их идентификация и оценка активности является первоочередным мероприятием по оценки функции иммунитета. В общей практике такие исследования проводятся ежедневно в большом количестве при исследовании клинического анализа крови (см. гл.6). Однако для детального изучения клеток иммунной системы этого исследования недостаточно. В клинической практике и научных исследованиях широкое применение нашли методы основанные на идентификации поверхностных дифференцировочных антигенов на клетках иммунной системы с помощью моноклональных антител. Суть метода заключается в связывании дифференцировочных АГ лимфоцитов с моноклональными АТ и дальнейшим их окрашиванием антиглобулиновыми АТ, меченными флуорохромом (метод непрямой иммунофлуоресценции). В дальнейшем происходит измерение меченых клеток с помощью различных методов где безусловнывм лидером является проточная цитометрия.

Проточная цитофлуориметрия – современная технология быстрого измерения характеристик клеток при помощи моноклональных антител или других зондов, позволяющая судить об их типе (по наличию того или иного набора клеточных маркеров) и их функциональном состоянии (по изменению протекающих в них процессов).

Созданная для ускорения анализа в клинической цитологии и цитодиагностике, эта технология постепенно развилась в эффективный подход к решению многих важных задач биологии клетки, иммунологии, клеточной инженерии и т.д. Области применения проточной цитометрии весьма разнообразны.

Помимо морфологических характеристик клеток с помощью моноклональных АТ можно: достоверно определять популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов; выявлять стадию дифференцировки и активации клеток; оценивать уровень функциональной активности лимфоцитов; определять внутриклеточные и секретируемые цитокины; проводить исследования фагоцитоза; анализировать клеточный цикл, оценивать апоптоз и пролиферацию.

Технология измерения различных характеристик клеток или их органелл следущая: Клеточная суспензия, предварительно меченная флуоресцирующими моноклональными АТ или флуоресцентными красителями, подается к потоковому элементу. Клетки идут одна за другой, где в проточной ячейке их пересекает лазерный луч, под действием которого окрашенные клетки флуоресцируют. Далее через оптическую систему излучение попадает на регистрирующее устройство, где в дальнейшем обрабатывается.

С помощью проточной цитометрии можно определить размеры клетки, соотношение ядра и цитоплазмы, степень асимметричности и интенсивность флуоресценции. Допускаются измерение до 21 флуоресцентного параметра одновременно и с высокой чувствительностью и воспроизводимости при шести длин волн возбуждения (до 6 лазеров). При исследовании допустима оценка свойств от нескольких десятков до нескольких миллионов клеток. (рис. 56).

Анализ параметров прямого (FS) и бокового (SS) светорассеяния позволяет получить информацию о таких параметрах клеток как относительный размер и «гранулярность», соответственно. После удаления эритроцитов из образца периферической крови на основании анализа FS и SS можно выявить три основные популяции лейкоцитов (рис. 57).

Во-первых, — это лимфоциты, расположенные в левой нижней части гистограммы А. Несмотря на то, что лимфоциты являются весьма гетерогенной популяцией клеток, их морфологические параметры не отличаются разнообразием. Диаметр этих клеток в капле свежей венозной крови условно здоровых людей находится в пределах 8-10 мкм (в мазке крови после фиксации и окраски он составляет около 7-8 мкм). При микроскопии у всех типов лимфоцитов можно увидеть интенсивно окрашивающееся ядро округлой, реже бобовидной, формы, содержащее компактный гетерохроматин, локализированный по периферии ядра.

Ядро окружено относительно узким ободком базофильной цитоплазмы. В ней могут содержаться немногочисленные гранулы (следует отметить, что по этому параметру зрелые НК-клетки и цитотоксические Т-лимфоциты могут существенно отличаться от В-клеток и Т-хелперов, так как в их цитоплазме накапливаются гранулы, содержащие цитолитические молекулы). Обычно в гистологических исследованиях лимфоциты описываются как клетки, обладающие высоким ядерно-цитоплазматическим отношением (отношение между площадью цитоплазмы и площадью ядра).

Во-вторых, — это моноциты, расположенные несколько выше по FS и правее по SS от популяции лимфоцитов. Как известно, моноциты имеют диаметр в свежей капле венозной крови в пределах 9-12 мкм (в мазке крови – 18-20 мкм) – поэтому их относительный размер превосходит таковой лимфоцитов (выше по FS). Структура цитоплазмы также несколько сложнее за счет наличия крупного ядра обычно бобовидной или подковообразной формы, по всему объему которого располагаются скопления гетерохроматина, а в составе обнаруживаются одно или несколько ядрышек. Структура цитоплазмы мелкозернистая из-за наличия мелких азурофильных зерен (лизосом) и иногда фагоцитарных вакуолей. За счет этих структур в составе ядра и цитоплазмы, способных преломлять свет, моноциты обладают более высокими параметрами бокового светорассеяния по сравнению с лимфоцитами. Моноциты тоже являются гетерогенной популяцией клеток, однако их разделение на отдельные группы проводится на основании экспрессии поверхностных молекул (в первую очередь, CD14 и CD16).

В-третьих, — это гранулоциты, расположенные выше по оси ординат и правее по оси абсцисс по сравнению с моноцитами. Подавляющее большинство клеток в рамках гранулоцитарной популяции относится к нейтрофильным гранулоцитам. Нейтрофилы циркулируют в периферической крови в виде сферических клеток диаметром от 12 до 15 мкм, что существенно превосходит размеры лимфоцитов и моноцитов (отсюда такое «высокое» расположение по FS). Ядро нейтрофила сегментировано и может состоять из трех-пяти связанных между собой долек, отсюда еще одно название нейтрофила – «полиморфно-ядерный лейкоцит». Цитоплазма содержит большое число гранул, которые подразделяются на два основных типа. Большинство гранул – это «специфические» гранулы, заполненные такими протеолитическими ферментами как лизоцим, коллагеназа и эластаза. Эти гранулы не сильно окрашиваются основными и кислотными красителями (гематоксилин и эозин, соответственно), что отличает гранулы нейтрофилов от гранул двух других типов циркулирующих гранулоцитов, называемых базофилами и эозинофилами (по окраске, соответственно). Второй тип гранул нейтрофила – это азурофильные гранулы (лизосомы), в составе которых обнаруживаются различные ферменты и другие микробицидные вещества, включая дефенсины и кателицидины. Наличие большого числа гранул, а также сегментов, на которые разделено ядро, существенно увеличивают способность этих клеток рассеивать или преломлять свет, который собирается детектором бокового светорассеяния, что делает эту группу клеток самой сложной по организации внутреннего объема цитоплазмы среди всех лейкоцитов периферической крови.

Что же касается двух других популяций лейкоцитов – базофилов и эозинофилов, то для их выявления необходимо использовать флуорохром-конъюгированные моноклональные антитела, так как по параметрам светорассеяния они «накладываются» на популяции лимфоцитов и гранулоцитов, соответственно. Дендритные клетки, которые могут обнаруживаться в незначительном количестве в периферической крови, по прямому и боковому светорассеянию обычно располагаются между лимфоцитами и моноцитами, не формируя четко оформленных популяций. Для их выявления также необходимо применять моноклональные антитела, конъюгированные с флуорохромами.

В случае некачественного лизирования эритроцитов (не полного их удаления из образцов) выявление популяции лимфоцитов для последующего анализа не представляется возможным. Это связано в первую очередь с тем, что относительные размеры лимфоцитов и эритроцитов, определяемые при помощи прямого светорассеяния, практически полностью совпадают, как это показано на рисунке 58. Поэтому долгое время искали методический прием, позволяющий не зависеть от качества лизирования эритроцитов в образцах. Преимуществом использования антител против CD45 является почти что полная независимость от качества лизиса эритроцитов на этапе подготовки образца для анализа, что позволяет практически всегда выделить популяцию лимфоцитов для последующего детального исследования. Именно поэтому анализ экспрессии CD45 на лейкоцитах периферической крови входит в международные рекомендации по клеточному анализу в качестве одного из первых этапов. Основным недостатком этого метода является необходимость использования дополнительного моноклонального антитела, что в целом способно увеличить стоимость исследования. Кроме того, это требует задействовать отдельный флуоресцентный канал для измерения интенсивности флуоресценции CD45, что накладывает определенные ограничения в случае работы приборов с малым количеством одновременно анализируемых флуоресцентных сигналов.

CD45, также известный как LCA (от англ. «leukocyte common antigen») или T200, является трансмембранным гликопротеином I типа с молекулярной массой 180-240 кДа (в зависимости от изоформы молекулы), в составе внутриклеточной части полипептидной цепи которого находятся два каталитических домена, обладающие свойствами тирозиновых протеинфосфотаз. Тирозинспецифическая фосфатаза СD45 принимает участие в передаче сигналов внутрь клетки и регулирует различные процессы, связанные с активацией клеток, продвижением их по клеточному циклу, дифференцировкой и т.д. Однако в случае проточной цитометрии антитела против данной молекулы применяются для того, чтобы отделить лейкоциты от неклеточных элементов крови (эритроцитов и тромбоцитов, не экспрессирующих CD45 на своей поверхности).

Уровень экспрессии CD45 существенно различается и среди различных субпопуляций лейкоцитов. Так, лимфоциты (Т- и В-клетки, а также натуральные киллеры) обладают очень высокой плотность экспрессии данной молекулы, что, принимая во внимание относительно небольшую структурированность их цитоплазмы (отсутствие крупных гранул, шаровидное ядро, богатое гетерохроматином, и т.д.), позволяет отделить эти клетки от остальных клеток крови при помощи гистограммы «боковое светорассеяние»-против–экспрессии CD45. и описать их как SSlowCD45bright. На моноцитах периферической крови экспрессия CD45 несколько уступает таковой на лимфоцитах, при этом организация цитоплазматического компартмента моноцитов значительно сложнее за счет наличия лизосом и крупного ядра, имеющего бобовидную, подковообразную или, реже, дольчатую форму с многочисленными выступами и углублениями. Все это позволяет выявить популяцию моноцитов как SSdimCD45dim. Что же касается гранулоцитов (в первую очередь, нейтрофилов, которые в норме составляют подавляющее большинство клеток данной фракции), то на нейтрофилах плотность экспрессии CD45 уступает таковой на лимфоцитах и моноцитах. Однако, именно эти клетки характеризуются наличием огромного числа структурных элементов в своей цитоплазме – специфические гранулы и лизосомы, а также сильно сегментированное ядро, что позволяет относить их к полиморфоядерным лейкоцитам. Используя терминологию, принятую в проточной цитометрии, нейтрофилы можно описать как SShighCD45dim.

Помимо CD45 на клетках иммунной системы находятся и другие рецепторы, которые можно определить с помощью моноклональных антител или каких либо других зондов (иммунофенотипировать).

Набор клеточных маркеров позволяет судить о типе (табл.33) и функциональном состоянии (табл.34) той или иной клетке.

CD-антигены, определяющие тип клетки

Оценка функции фагоцитарных клеток. Процесс фагоцитоза состоит из нескольких этапов: хемотаксис, адгезия, поглощение, дегрануляция, киллинг и разрушение объекта фагоцитоза. Их изучение имеет определенную значимость в оценке фагоцитарного процесса, так как существуют иммунодефициты, связанные с наличием поломок практически на каждом этапе.

Адгезивную способность нейтрофилов можно измерить по прилипанию к волокнам из нейлона.

Миграцию и хемотаксис фагоцитирующих клеток оценивают при использовании агарозных тестов (реакция торможения миграции лейкоцитов). Поглотительную способность лейкоцитов измеряют по захвату ими различных частиц (микроорганизмы, частицы латекса). Метаболическая активность клеток может быть оценена в тесте с нитросиним тетразолием (НСТ-тест) или с помощью хемилюминесцентного метода.

CD-антигены, используемые для оценки функционального состояния клеток иммунной системы.

Показатели фагоцитарной активности нейтрофилов оцениваются в тестах спонтанного и стимулированного микробными полисахаридами (продигиазаном и зимазаном) фагоцитоза, что позволяет при сравнении аналогичных показателей до и после стимуляции оценивать резервные возможности клеток.

Определяется поглотительная способность нейтрофилов с подсчетом фагоцитарного индекса, т. е. процента (относительного числа) фагоцитирующих нейтрофилов. Оценивается фагоцитарное число, или среднее число частиц, поглощенных одним нейтрофилом. Метод основан в умении полиморфноядерных лейкоцитов (или моноцитов) периферической крови связывать на своей поверхности, поглощать и переваривать чужеродные агенты (микробные агенты, индифферентные частицы, например, используемый в тестах латекс). Бактерицидная активность фагоцитов основана на подсчете жизнеспособных бактерий, оставшихся внутри клеток после инкубации. В норме фагоцитарный показатель составляет: спонтанный – 62–68 %, стимулированный – 80–88 %. Фагоцитарное число – спонтанное 3–5, стимулированное 7–11.

Фагоцитарная активность нейтрофилов обычно повышается в начале развития воспалительного процесса. Ее снижение ведет к хронизации заболевания, развитию синдрома ИК за счет того, что нарушается функция разрушения и выведения ИК.

Учитывая, что главным итогом работы нейтрофила и моноцита являются киллинг и разрушение микроба, т.е. завершенный фагоцитоз, то для оценки киллинга можно рекомендовать образование активных форм кислорода в процессе фагоцитоза. Если нет возможности определять активные формы кислорода с помощью хемилюминесцентного метода, то о появлении супероксидного радикала можно судить по восстановлению НСТ. Но в данном случае следует помнить, что киллинг микробов в фагоците осуществляется с помощью как кислородозависимых, так и кислородонезависимых механизмов, т.е. определение активных форм кислорода не дает полной информации об этом процессе.

Иммуногистохимия

Еще один метод, основанный на принципе специфического связывания антител с антигенами в биологических тканях.

По методу визуализации выделяют хромогенную иммуногистохимию, при которой антитело конъюгировано с ферментом, таким как пероксидаза (комбинация, называемая иммунопероксидазой), который может катализировать реакцию образования цвета и иммунофлуоресценция, когда антитело мечено к флуорофору (флуоресцеину или родамину).

Иммуногистохимическое окрашивание широко используется как для фенотипирования и/или диагностики аномальных клеток, так и для определения клеточных событий, таких как пролиферация или гибель клеток (апоптоз и другие виду клеточной смерти).

Следующим шагом развития проточной цитометрии является иммуноскопия — проточная цитометрия с визуализацией (ПЦВ) (рис.59) или проточная микроскопия. Наиболее полно данная революционная технология реализована в проточном цитометре Amnis ImageStream®X Mk II (Luminex, USA), который сочетает в себе возможности проведения высокопроизводительного, многопараметрического анализа методом проточной цитометрии с получением морфологических и пространственных параметров методом микроскопии на уровне единичной клетки. Этa уникальная комбинация позволяет использовать широкий спектр алгоритмов с анализом изображения клеток для получения множества научных и/или клинических данных, которые невозможно осуществить цитометрическими и микроскопическими методами отдельно.

За несколько минут прибор может обработать сотки тысяч клеток, получив и охарактеризовав несколько миллионов изображений как самих клеток, так и их флуоресценции. Высока производительность делает данную технологию подходящей для анализа редких типов клеток (таких как циркулирующие опухолевые клетки) и переходных состояний (фазы клеточного цикла).

Анализ изображений, полученных методом ПЦВ, позволяет получить множество параметров интересующих объектов (включая белки, нуклеиновые кислоты и гликолипиды) в различных областях клетки (ядро, митохондрии и тд). Большое количество получаемой информации делает ПЦВ идеальной платформой для высоко контентного анализа и машинного обучения, помогая создавать профили сложных клеточных фенотипов, идентификации редких событий и, что не мало важно, поиска мишеней для диагностики заболеваний, в персонализированной медицине и разработке лекарств.

В перспективе, ПЦВ может применяться, например, для диагностики острой или хронической лимфоцитарной/миелойдной лейкемии в неокрашенных/необработанных образцах крови, что позволит сохранить «естественные» свойства и состояние образцов. Или автоматизировать быструю визуализацию клеток интереса, характер локализации экспрессирующих антигенов и оценку цитогенетические аномалии в одном тесте.

Другие потенциальные применения ПЦВ – поиск редких клеток в биологических жидкостях, например, поиск остаточных лейкозных клеток после лечения, жидкостная биопсия и анализ циркулирующих опухолевых клеток. ЖБ может выявлять рак на ранней стадии, циркулирующие метастатические клетки или лекарственно-устойчивые неопластические клетки, нарушения свертываемости или аномалии развития плода. Использование алгоритмов машинного обучения совместно с ПЦВ позволяет выявлять одну опухолевую клетку среди миллионов нормальных с очень высокой точностью.

Несмотря на огромные перспективы технологии, в основном она используется в научных целях. Одним из основных препятствий можно назвать анализ данных: он сильно разница от эксперимента к эксперименту, требует ручная настройка и интерпретации. Однако эти препятствия можно с легкостью преодолеть, используя машинное обучение. Кроме того, для ПЦВ требуется внедрение СОПов с стандартизованного контроля качества работы приборов. Хотя это и является обычной практикой в традиционной проточной цитометрии, в ПЦВ это до сих пор не внедрено.

Стратегия гейтирования при исключении событий, неудовлетворяющих требованиям циркулирующих эндотелиальных клеток и последующее визуальное подтверждение.