Масс-спектрометрия – метод измерения массы молекул или атомов ана-лизируемого вещества, основанный на измерении отношения массы заряженных частиц вещества к их заряду (m/z). В основе идентификации микроорганизмов с помощью этого метода лежит получение спектра константных белков неизвест-ного микроорганизма и последующее сравнение полученного спектра с базой данных. Приборы, которые реализуют этот метод, называются масс-спектрометрами.
Общая схема масс-спектрометрии
Наибольшее распространение получила MALDI TOF-спектрометрия.
MALDI (матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация) – спо-соб ионизации вещества, использующийся при масс-спектрометрии. В основе метода лежит использование вспомогательного вещества – «матрицы», свойства которого обуславливают понижение деструктивных свойств лазерного излуче-ния и ионизацию анализируемого вещества. TOF (Time of Flight – времяпро-летный) – принцип устройства анализатора масс-спектрометра, в котором заря-женные частицы разделяются по времени пролета определенного расстояния. При этом время пролета частицы пропорционально отношению массы данной частицы к ее заряду.
Процедура пробоподготовки состоит в перенесении единичной колонии микроорганизмов на мишень прибора и наслоении раствора матрицы поверх анализируемого образца. Мишень прибора с нанесенными образцами помеща-ется в масс-спектрометр. С образца снимается суммарный спектр, состоящий из 240 единичных спектров. Суммарный спектр преобразуется в «основной спектр» (набор пиков разных масс), который сравнивается со спектрами базы данных. При сравнении для каждого спектра из базы данных высчитывается ко-эффициент совпадения со спектром неизвестного микроорганизма. Микроорга-низм, чей масс-спектр имеет наибольшее значение данного коэффициента, вно-сится в таблицу результатов. При этом достоверными считаются результаты, для которых значение коэффициента совпадения выше определенной величины. Время проведения исследования одного образца — менее 1 минуты.
Визуализация масс-спектров
(масс-спектрометр MALDI для идентификации микроорганизмов, BactoSCREEN)
С помощью данной методики возможно не только идентифицировать возбудителя, но и определить его чувствительность к антибактериальным препаратам. Для этого суспензию бактериальной культуры инкубируют с антибиотика-ми. Если бактерия чувствительна к антибиотику, происходит лизис клетки, и белки оказываются в супернатанте, на спектре присутствуют пики бактериальных белков. Если бактерия устойчива к антибиотику, клеточного лизиса не происходит, в спектре пиков нет. В обоих случаях отсутствует деградация бактериальной клетки в контрольном образце, куда не добавляется антибиотик.
MALDI масс-спектрометрия, бактерия чувствительна к антибиотику
MALDI масс-спектрометрия, бактерия устойчива к
антибиотику
Газовая хромато-масс-спектрометрия – современный метод, используемый для дифференциации и идентификации микроорганизмов (МО). Он основан на сочетании двух аналитических методов: капиллярной газовой хромато-графии и масс-спектрометрии. Принцип метода – качественное и количествен-ное определение маркерных веществ микроорганизмов (жирных кислот (ЖК), альдегидов, спиртов, стеринов и др.) непосредственно в исследуемом материале. Наличие специфических веществ (маркеров) в исследуемых образцах открывает возможность для направленного поиска и идентификации МО. Для исследования может быть использован любой биологический материал, взятый от пациента. Исследование универсально в отношении разных групп микроорганизмов: бактерий, в том числе анаэробных микроорганизмов, микроскопических грибов, вирусов.
Газовая хромато-масс-спектрометрия микробиома (ГХМС М) – это метод детектирования микрофлоры по видоспецифическим высшим жирным кислотам клеточной стенки микроорганизмов. Разработка метода принадлежит группе российских ученых под руководством доктора биологических наук, профессора микробиологии Осипова Г. А. Суть исследования состоит в прямом извлечении высших жирных кислот из образца биоматериала, их разделении на хроматографе в капиллярной колонке высокого разрешения и анализе состава на масс-спектрометре. На основании этих измерений расшифровывается состав микробиоты (полученные профили сравнивают с серией библиотек профилей и списком бактерий с наиболее похожими профилями). В ходе исследования в одном анализе определяется более 56 микроорганизмов одновременно. Результат исследования выдается в виде списка исследуемых микроорганизмов, допустимых значений нормы и отклонений от нормы, а также диаграммы в сопоставлении с нормой. Чувствительность составляет 104-105 клеток в пробе, селективность – до вида при наличии маркера.
