Микроскопические методы исследования дают возможность быстро обнаружить характерные морфологические особенности возбудителя и имеют важное диагностическое значение при диагностике ряда заболеваний. В основе современных лабораторных методов исследования лежит световая микроскопия с многочисленными ее разновидностями, такими как темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная и др. Электронная микроскопия, используемая для изучения более мелких объектов (вирусов и структур микроорганизмов), применяется в основном в крупных научно-исследовательских институтах.
Препараты для световой микроскопии (нативные или окрашенные) готовят в момент взятия проб или сразу после поступления их в лабораторию.
Используя различные способы наблюдения и методы окраски, с помощью рутинной микроскопии, воз-можно идентифицировать большинство простейших, гельминтов, бактерий и грибов. Нативная (световая, фазово-контрастная и темнопольная) микроскопия позволяют рассмотреть возбудителей, не прибегая к фиксации и окраске.
Treponema рallidum
Темнопольная микроскопия
Микроскопическое исследование соскобов кожи, ногтевых пластинок, во-лосяных фолликулов используется для диагностики поверхностных микозов кожи, ее придатков и демодекоза. Выявление спор и мицелия дерматофитов, плесневых грибов (Scopulariopsis brevicaulis, Реnicillium spp. и др.) или псевдо-мицелия дрожжеподобных грибов рода Candida и их сочетаний с очагов пора-жения ногтевых пластинок, кожи, волос является подтверждением микозов раз-личной этиологии.
Грибы рода Candida, псевдомицелий, почкующиеся клетки
Нативная микроскопия
Malаssezia furfur, отрубевидный (разноцветный) лишай
Соскоб кожи. Нативная микроскопия
с 10% КОН
Наличие в препарате клещей, личинок, яиц, пустых яйцевых оболочек клеща рода Demodex и Sarcoptes позволяют определить причину фолликулитов, акне, зудящихся высыпаний на коже.
Demodex folliculorum hominis
Нативная микроскопия
Sarcoptes scabiei (чесоточный зудень)
Нативная микроскопия
Морфологию бактерий изучают, как правило, на фиксированных и окра-шенных препаратах, т.к. неокрашенные микроорганизмы, плохо различимы в световом микроскопе из-за их малой контрастности. Качественное окрашивание позволяет правильно идентифицировать некоторые бактерии и оценить их осо-бенности. Способность и индивидуальная особенность микроорганизмов окра-шиваться теми или иными красителями называются их тинкториальными свой-ствами. При использовании способа окраски по Граму и его модификаций бак-терии подразделяют на две группы: грамположительные, окрашенные в сине-фиолетовый цвет, и грамотрицательные, имеющие розовый или красный цвет (рис. 95). При окраске по Цилю-Нильсену возможно идентифицировать микобактерии туберкулеза и другие кислотоустойчивые бактерий
Окраска по способу Грама
Грамотрицательная флора
Окраска по Ziehl-Neelsen
Кислотоустойчивые микроорганизмы
При микроскопии окрашенных препаратов из любого биологического ма-териала всегда оценивается состояние эпителия, лейкоцитарная реакция, коли-чественный и качественный состав микрофлоры.
Цитологическое исследование позволяет изучить качественный и количе-ственный состав клеток, характерных для данной локализации в норме или по-являющихся при аллергических, инфекционных заболеваниях, злокачественных опухолях.
Выраженность лейкоцитарной реакции, проявление фагоцитоза, его за-вершенность позволяет оценить степень тяжести воспаления. Так, например, незавершенный фагоцитоз позволяет определить недостаточность фагоцитарного звена иммунитета.
Нейтрофильный лейкоцитоз
Микроскопия периферической крови
Грибы рода Candida в нейтрофиле
Спектр бактерий меняется в зависимости от локализации в организме (за-селения тех или иных слизистых оболочек и органов), исследование препаратов позволяет дать полуколичественную оценку общей микробной обсемененности, оценить качественный состав микрофлоры (морфотипы), обнаружить элементы грибов.
Флора полиморфная, грамотрицательная
Окраска по способу Грама
Грибы рода Candida
Окраска по способу Грама
При исследовании отделяемого мочеполовых органов можно поставить диагноз трихомониаза и гонореи.
Микроскопия отделяемого мочеполовых органов
а) T.vaginalis, окраска метиленовым синим; б) Гонококк, окраска по способу Грама
Микроскопия мазков крови, окрашенных по методу Романовского – Гимза позволяет выявить возбудителей малярии в первые дни болезни или поставить диагноз инфекционного мононуклеоза
Трофозоит Plasmodium vivax
Тонкий мазок крови
Атипичные мононуклеары при инфекционном мононуклеозе
Макро- и микроскопические паразитологические методы лабораторной диагностики являются прямыми методами обнаружения гельминтов, их фрагментов, яиц и личинок.
На поверхности кала после дефекации можно увидеть активно ползающих остриц; иногда выделяются с калом аскариды; у больных дифиллоботриозом могут выделяться обрывки стробилы лентеца (в виде «лапши»), а у инвазированных тениидами (свиной или бычий цепень) с калом часто отходят членики гельминтов (в виде «белых обсечек»), членики бычьего цепня могут активно выползать из анального отверстия. В случаях тениаринхоза макроскопический метод диагностики является основным. Для выявления мелких гельминтов применяют ручную лупу. Но выход большинства гельминтов и их фрагментов из организма хозяина наблюдается не всегда. Поэтому для диагностики чаще используют методы гельминтоово- и лавроскопии. Световая микроскопия по-прежнему используется в качестве основного метода диагностики подавляюще-го большинства паразитарных заболеваний: по морфологическим особенностям обнаруженных яиц, личинок, цист может быть установлен вид паразита.
В практике чаще всего приходится исследовать фекалии, так как именно через кишечный тракт выводятся яйца подавляющего большинства гельминтов и цист простейших. Реже исследуют другие субстраты – желчь, мокроту, мочу и др.
Все пробы фекалий, поступающие в лабораторию, исследуют на наличие гельминтов, их яиц или личинок, а также цист простейших. Биологический материал должен быть доставлен и исследован менее чем через сутки после сбора, так как при длительном хранении яйца и цисты могут деформироваться, личинки гельминтов разрушаются в течение 1 — 2 часов. Чтобы выявить все возможные паразитарные инвазии у конкретных пациентов, обычно требуется исследовать от 3 до 5 проб с 3-дневным интервалом.
Трофозоит Entamoeba histolytica
Вегетативные формы простейших можно обнаружить только в дуоденальном содержимом или в жидком кале при поносах или после назначения слабительного. Исследование кала в течение 30 – 40 мин. после дефекации позволяет провести дифференциальную диагностику простейших по типичному движению живых паразитов. Цисты обнаруживаются чаще в оформленном кале, они выделяются периодически поэтому, для подтверждения диагноза рекомендуется проводить исследования кала 5 – 6 раз на протяжении 2 – 4 нед.
Основной метод обнаружения яиц гельминтов – метод исследования толстого мазка под целлофаном по Като, выявляются яйца кишечных и печеночных гельминтов при высокой и средней интенсивности инвазии
Методы исследования перианальных отпечатков применяются для диагностики энтеробиоза и тениаринхоза.
Яйца Diphyllobotrium latum
Метод Като
Яйца Enterobius vermicularis
Мазок-отпечаток с перианальных складок
Нативный препарат с йодом используют для окрашивания гликогена и ядер у цист, для их видовой идентификации.
Анализ нативных препаратов является наиболее простым и легким мето-дом исследования, но может пропустить низкую степень инвазии. Поэтому обя-зательно следует использовать методы обогащения, например, модификацию метода седиментации с применением одноразовых концентраторов кала. Ком-плект концентраторов состоит из разборных пластиковых пробирок, содержа-щих все необходимые для работы готовые реактивы. Образец, взятый в такую пробирку, может храниться 24 часа при комнатной температуре.
Иммунологические методы (обнаружение антител) применяются только в острой фазе гельминтозов (миграция личинок), при личиночных гельминто-зах, при эктопической локализации гельминтозов, при тканевых протозоозах.
Люминесцентную микроскопию широко применяют для выявления анти-генов и антител (метод иммунофлуоресценции). С ее помощью можно увидеть микробов, которые содержат определенные антигены. Для их выявления необ-ходимо иметь специфические люминесцентные сыворотки, которые вызывают флуоресценцию именно данного антигена. Этот метод успешно используют для экспресс-диагностики многих бактериальных и вирусных заболеваний (см.выше).
Для изучения строения микроорганизмов на субклеточном и молекулярном уровнях, а также для исследования структуры и архитектоники вирусов используют электронный микроскоп.
